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PCR系列

1)、不出现扩增条带
a)、引物设计有误:核对引物设计方案。 b)、扩增体系配制错误:重复实验。 c)、扩增反应条件不优化:调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序。 d)、模板质粒质量偏差:长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的质粒作为模板。 e)、模板的GC含量:GC含量过高会导致DNA的双链无法完全打开,此时加入PCR Enhancer(货号P021)可以有效降低解链温度;GC含量过低会导致扩增效率较差,可适当延长引物长度或通过TD PCR摸索合适的反应条件。

2)、出现非特异性扩增带
a)、引物设计不够优化:引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体,可降低引物浓度进行优化,必要时重新设计引物。 b)、模板不纯:模板被污染,需重新制备模板。 c)、试验条件不够优化:如果出现比目的条带小的杂带,可通过提高退火温度、降低循环数调整;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数;另外,可降低Mg2+及酶的浓度。

3)、条带弥散或拖尾
a)、模板降解或过量:可通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新纯化模板,对于简单模板(例如质粒、λDNA),每50ul反应使用1pg-10ng DNA;对于复杂模板(例如基因组、cDNA),每50ul反应使用1ng-1ug DNA。 b)、酶量加太多:如高保真系列:50ul反应体系加1U,Taq系列:50ul体系加2U。

4)、条带很暗
a)、增加模板量,提高循环数。 b)、多扩几管,胶回收浓缩。

5)、产物有错配
a)、检查原始模板是否原本就是突变或错配的。 b)、少量序列存在非严谨序列,有相似重组序列,导致重组错位。

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