HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR_南京诺唯赞生物科技有限公司

HiScript^® II Q Select RT SuperMix for qPCR

可灵活选择逆转录引物的两步法RT-qPCR 首选预混液

基于高效的HiScript^® II Reverse Transcriptase，逆转录效率更高

针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物

即用型SuperMix 预混液使用方便省时

本产品以高性价比的HiScript^® II Reverse Transcriptase为基础，使用设计独特的Oligo(dT) 23 VN 引物，提高了反应特异性及灵敏度，获得质量更好的cDNA。针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物，满足多样化的实验需求，可根据逆转录后续实验需要选择Oligo (dT) ₂₃ VN primer/Random Hexamers 或基因特异性引物（GSP）。同时对反应体系进行大幅简化，5 × qRT SuperMix 含有反转录反应除引物以外所需的全部试剂且在-20℃不会冻结，使用方便。

组分	R233-01 100 rxn (20 μl/rxn)
RNase free ddH₂O	2×1 ml
4 × gDNA wiper Mix	400 μl
5 × HiScript^® II Select qRT SuperMix II ^a	400 μl
Oligo (dT)₂₃VN (10 μM)	100 μl
Random hexamers (50 ng/μl)	100 μl
5 ×Select No RT Control Mix ^b	40 μl

a. 包含Buffer、dNTP Mix、HiScript^® II Reverse Transcriptase、RNase inhibitor。

注意：与HiScript^® II Q Select RT SuperMix for qPCR (R232-01)中所带的5 ×HiScript^® II Q Select qRT SuperMix成分不同，不可以混用。

b. 除不含HiScript^® II Reverse Transcriptase外，其余成分与5 × HiScript^® II Select qRT SuperMix II相同，用于配制No RTII相同，用于配制No RT对照反应。

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Q1：原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗？

A1：可以。原核生物RNA没有polyA尾，所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。

Q2：逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix，可以去除残留在RNA中的基因组。最多可以去除多少的基因组？但如果不进行基因组去除，会影响接下来的逆转录吗？

A2：我们做过100ng基因组的测试，去除效率是99.95%。如果不进行基因组去除不会影响逆转录实验的进行，但是如果基因组残留严重但不去除的话，会影响接下来定量实验的准确性。

Q3：延长逆转录时间，是否可以提高逆转录效率？

A3：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升；对于一些GC含量较高或含高级结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。

Q4：做了No RT Control发现有gDNA残留怎么办？

A4：如果使用试剂盒中的gDNA wiper模块进行gDNA去除，但No RT Control仍有C_T值，可通过实验组和No RT Control组的C_T值来判断实验数据是否可用。当实验组C_T值与No RT Control对照组C_T值差值大于5，说明由gDNA导致的误差小于5%，则可以忽略gDNA污染；若实验组与对照组C_T值差值小于3或者几乎一致，则实验组扩增产物的模板很大一部分来源于gDNA，这样的实验组就失去定量意义。

Q5：如何评判RNA质量？

A5：RNA质量从两个方面反应：

(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则 RNA 已完全降解，需要重新提取。

(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD_260/280和OD_260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断，蛋白、离子等残留会使比值降低。

Q6：如何选择逆转录的引物？

A6：根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。

(1) 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

(2) Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

(3) 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。

cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。

Q7：可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？

A7：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。

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