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Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase
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Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase

货  号:
P501-d1/d2/d3
价  格:
¥
340.00
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Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase

卓越保真度和扩增能力的高保真DNA 聚合酶

保真度是Taq DNA Polymerase的52倍,是Pfu DNA Polymerase的6倍

扩增速度是常规聚合酶的4-150倍

广泛的模板适应性

优化的缓冲体系广泛适用于各种类型模板,便于快速得到理想的扩增结果

 

图1

使用Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase以λ DNA为模板扩增长度分别为200 bp、600 bp、800 bp、1 kb、1.2 kb、2.0 kb的目标片段,延伸时间设置为1秒。所有片段均可以实现特异性高产量扩增。

图2

使用Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase以λ DNA为模板扩增长度分别为5 kb、8 kb、10 kb、12 kb、15 kb的目标片段,延伸时间设置为3分钟。所有片段均可以实现特异性高产量扩增。

图3

使用LacI法测定,Phanta®保真性是普通Taq DNA聚合酶的52倍,是野生型Pfu DNA聚合酶的6倍。

(Cline et al. , Nucleic Acids Research,24: 3546-3551(1996))

Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase是一种基于Pfu DNA Polymerase改造而成的新一代超保真DNA聚合酶,具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性,可用于几乎所有PCR反应。经过对Pfu DNA Polymerase的基因工程改造,Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase的行进性(processivity)得到了大幅度提升,即使是非常复杂的模板,也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/52,是Pfu酶的1/6,且其扩增速度可以达到15秒/kb。5 × Phanta® SF反应缓冲液对于简单或复杂模板、短片段或长片段PCR扩增都具有良好的适应性。缓冲液中已经含有10 mM Mg2+(1 × 终浓度为2 mM),可以使用随酶提供的DMSO或MgSO4对反应体系进行优化。附带的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的扩增。

组分

P501-d1(100U)

P501-d2(500U)

P501-d3(1000U)

5 × SF Buffer (with 10 mM MgSO4)

1.25 ml

5×P501-d1

10×P501-d1

25 mM MgSO4

1 ml

dNTP Mix (10 mM each)

100 μl

Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)

100 μl

5 × PCR Enhancer

500 μl

DMSO

100 μl

10 × Loading buffer

1.25 ml

-20°C保存

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:扩增效率低,实验组无扩增条带。

A1:(1) 引物

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解;引物设计是否合理,可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

(2) 模板

长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开,此时加入PCR Enhancer(货号P021),可以有效降低解链温度;模板的AT含量过高,可尝试使用针对高AT的产品(货号P501/P511);模板为粗品,存在抑制物,建议降低模板浓度(稀释使用;若样本为植物叶片,要确保植物为非多糖多酚植物,取新鲜幼嫩的叶片,并将叶片面积剪小,如黄枪头尖部面积大小);若模板为cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。

(3) 酶

反应所用的酶因保存或运输不当而失活,建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。

(4) 扩增体系

反应体系配制错误,建议重复实验。

(5) 反应程序

检查变性温度是否准确,PCR仪指示温度与实际温度是否相符,如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活,温度过低则模板变性不彻底;若模板为酵母菌,可将预变性时间延长10min;退火温度不合适,可对退火温度设置梯度,摸索最佳的退火温度;如果目的片段较长,可尝试Touch Down 程序;检查延伸时间是否充足。

(6) Mg2+浓度不合适

Mg2+浓度过低可影响PCR产量甚至使PCR扩增失败;Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性,应适当调整Mg2+浓度。

Q2:扩增的条带亮度不太亮。

A2:(1) 引物

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解。

(2) 模板

首先确认模板的质量,长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;如果模板没有了,可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。

(3) 酶

可适当提高酶的使用量。

(4) 反应程序

可尝试使用Touch Down程序;延长延伸时间,提高循环数。

Q3:扩增特异性差,非特异性扩增。

A3:(1) 引物

引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体,可降低引物浓度进行优化,必要时重新设计引物。

(2) 模板

模板不纯,被污染,需重新制备模板。

模板降解或过量,通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。

(3) 反应程序

反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带,可通过提高退火温度,降低循环数调整;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。

(4) 酶

酶量加入过多。高保真系列:50μl体系加1U。

Q4:扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。

A4:(1) 胶

制胶时要使胶完全融化。

(2) 引物

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解。

(3) 模板

模板降解或过量,可通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新制备模板。模板的使用量请参考说明书。如果目的条带较长,模板是cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度,逆转录时不加随机引物重新逆转录。

(4) 反应程序

反应程序不够优化。退火温度不合适,可对退火温度设置梯度,摸索最佳的退火温度;尝试Touch Down 程序。

(5) 酶

酶量加入过多。高保真系列:50μl体系加1U。

Q5:空白对照出现扩增产物。

A5:(1) 引物设计不合理

扩增序列与非目的扩增序列有同源性,PCR也可以扩增出非靶序列的序列。

(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致,说明有污染

更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。

(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染,可用巢式PCR方法减轻或消除污染。

Q6:高保真酶扩增保真性差,存在突变。

A6:高保真酶在PCR时扩增产物有突变,可以从以下几点来分析:

(1) 模板本身存在突变

检查模板,若模板是质粒,建议送质粒去测序;若模板是cDNA,建议重复实验,如果仍有突变,可能是cDNA有问题,建议重新制备cDNA,制备cDNA前检测RNA的完整度及纯度。

(2) 模板反复冻融

重新制备模板。

(3) 模板长时间在紫外光下照射,引入突变

切胶回收过程中避免长时间在紫外光下照射。

(4) 基因序列与NCBI上的不一致

建议再重复一次送去测序,若结果和上一次一样,说明序列可能和NCBI上的不一致。

(5) 少量序列存在非严谨序列

有相似重组序列,导致重组错位。

Q7:条带大小与理论不符。

A7:(1) 实验体系污染

建议使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。

(2) 模板或引物使用错误

建议更换模板和引物。

(3) 存在基因亚型

建议对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

Q8:扩增产物跑胶时加样孔很亮,目的条带很暗。

A8:可能是循环数过多一些非特异性条带、蛋白、目的条带混合在一起形成大分子聚合物跑不下来。可向PCR产物中加入SDS,95℃加热5min,再跑胶。也可扩大体系,多扩几管,最后切胶一起回收。

Q9:逆转录后的产物cDNA作为模板,使用P505,一次应该加多少体积?

A9:说明书建议cDNA模板使用量为1-5μl(不超过PCR反应总体积的1/10),可在这个范围内尝试不同的使用量,摸索最佳使用量。

Q10:高保真酶扩增完的产物是否带A,若后面要做TA克隆该如何进行?

A10:高保真酶扩增完的产物不带A,可尝试使用Vazyme无缝克隆产品C112/C113/C115;若后面做TA克隆可用普通的Taq酶进行加A反应。

具体加A方法:在10μl体系中,加入纯化后的PCR产物1-7μl,同时加入1μl 10×Taq Buffer(含MgCl2)、0.5μl 10mM dNTPs、0.2μl Taq DNA聚合酶(不加引物),最后用超纯水补足体系,72℃反应10-15min即可。

暂未实现,敬请期待
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