T7 High Yield RNA Transcription Kit

Q1: RNA产物片段大于预期。

A1: 如果电泳显示产物条带大于预期，可能原因：①质粒模板可能没有完全线性化；②有义链3’端为突出结构；③RNA存在未完全变性的二级结构。

建议确认模板结构，并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。

Q2: RNA产物片段小于预期。

A2: 如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：①模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列；②模板中GC含量高形成高级结构；③RNase污染。

不同的聚合酶识别不同的终止序列，若含是模板中含终止结构，建议尝试不同的RNA聚合酶。如果模板为高GC，建议加入SSB蛋白，以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致，请跑变性胶检测产物。

Q3：产物电泳拖尾现象。

A3: 电泳过程中有拖尾现象，可能原因：①实验操作过程被RNA酶污染；②DNA模板被RNase污染。体系中的RNA酶抑制剂只能抑制痕量的RNA酶残留，建议重新纯化模板DNA，并在实验过程中使用RNase-free的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase-free H₂O配制。

Q4：模板中间有一段Poly T中止序列，后面的序列可以转录出来吗？

A4：模板中有发卡结构会影响转录，序列一般不会影响转录。

Q5：使用TR101时的模板一定要是双链吗？

A5：至少T7启动子要是双链的。

Q6：合成的RNA如何纯化？是否有配套的过柱纯化盒子？

A6：我们没有配套的过柱纯化盒子。建议选择使用磁珠纯化。

Q7：体外转录试剂盒可以转录100bp的片段吗？

A7：只要模板如下图所示，可以转录。如果没有GGG，转录效率会很低。

Q8：使用线性化的质粒时，线性化质粒的方法有哪些？

A8：酶切（注意选择酶切位点时不要选择3’端突出的酶切位点）、反向PCR（得到的就是PCR产物）。

Q9：使用质粒作为模板时，在线性化的过程中，为什么需要使用平末端或者5’突出末端的限制性内切酶进行线性化？

A9：原因和环状质粒为模板相似，都是会因为没有终止子而无限循环下去，从而导致生成的产物片段大小不一。

Q10：sgRNA条带模糊。

A10：sgRNA是100nt左右的单链RNA，在水溶液中容易形成二级结构，因此电泳时会位置会发生变化，采用加速冷冻或者甲酰胺变性凝胶电泳可以改善电泳结果。

Q11：体外转录试剂盒适用的片段范围是多少？

A11：最小做过21bp的siRNA（TR102）,最大做过10kb。

Q12：针对大片段和小片段，转录的效率如何？

A12：大片段会出现条带弥散的情况，因为片段越长酶越容易从模板上脱落，所以得到的产物条带就不是那么集中，其他竞品公司的产品也会出现类似的情况。短的模板小于300nt的，较短的转录其实对反应有抑制作用，所以要适当延长反应时间，可以过夜16h。因为模板和酶进行结合时识别启动子的过程需要时间，所以模板太短时会对反应造成抑制作用，同时建议增加模板量至2μg。

Q13：模板中存在高级结构（高GC或是茎环结构），怎么做可以提高产量？

A13：提高温度，如果有很多高级结构存在可以建议加入SSB蛋白。

Q14：模板中存在类似于T7终止序列（也是一种茎环结构）怎么做可以提高产量？

A14：降低反应温度。

Q15：产物纯化方式比较。

A15：酚/氯仿抽提的优点是便宜，但是有可能会残留游离的核苷酸。柱提法优点可以将游离的核苷酸去除干净，但价格相对较贵。切胶回收的方法得到的产物更加均一。磁珠法优点是快速且回收效率高，可达到90%以上。

Q16：得到的产物量无法达到说明书说的100-150ug可能的原因及建议。

A16：(1) 产物长度小于300nt时，建议提高产物的投入量至2μg，适当延长反应时间。

(2) 阳性对照，试剂盒中提供的阳性模板大小在500bp左右，对于阳性对照的实验设计可以在选择反应2h后从20μl的体系中取出5-10μl确定产量，剩下的体积继续反应至实验组的反应时间相同后确定产量。

(3) 不同的纯化方式产生的损失是不同的。

(4) 可以重新纯化模板。

(5) 确定模板定量以及其完整性。

(6) 尝试其它的启动子和RNA聚合酶。

Q17：TR101可以用于合成mRNA吗？

A17：可以，但是要自己购买帽子类似物，说明书中提供的加帽RNA体系就是合成mRNA的体系，里面GTP和加帽类似物的浓度比例建议为1:4。

Q18：模板投入量增加为2μg时，NTP的量以及DNA酶的量是否需要调整？

A18：模板投入量增加为2μg时，NTP的量不用调整，若担心模板消化不彻底，可将DNA酶的量从1μl提高至3μl；

Q19：对照组投入0.5μg产出是多少？

A19：Control Template的长度约500bp，投入0.5μg，产出约150-200μg，最低130μg（转录后直接用Qubit测量浓度）。