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T7 High Yield RNA Transcription Kit
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T7 High Yield RNA Transcription Kit

货  号:
TR101-01/02
价  格:
¥
2300.00
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T7 High Yield RNA Transcription Kit

用于体外RNA 合成

优化的反应体系

每个反应产生高达150-200 μg的RNA产物

图1. 逆转录方案

图2. 反应时间与产量的关系

图3. 模板投入量与产量关系

 

T7 High Yield Transcription Kit 是优化的体外转录试剂盒,T7 RNA Polymerase 从模板DNA T7 的启动子下游开始合成与DNA 中一条链互补的RNA,简单快速获得大量的RNA 分子,转录时可在底物中加入修饰的核苷酸,制备生物素或染料标记的RNA。本试剂盒以0.5μg 的模板投入量可以产生150 μg-200 μg 的RNA,转录合成的RNA 可用于诸如RNA 结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。

组分

TR101-01(50 rxn)

TR101-02(100 rxn)

T7 RNA Polymerase Mix

100 μl

200 μl

10 × Reaction Buffer

100 μl

200 μl

ATP Solution

100 μl

200 μl

UTP Solution

100 μl

200 μl

GTP Solution

100 μl

200 μl

CTP Solution

100 μl

200 μl

DNase I

50 μl

100 μl

Control Template (0.5 μg/μl)

10 μl

20 μl

RNase-free H2O

1 ml

2 × 1 ml

-20℃保存

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1: RNA产物片段大于预期。

A1: 如果电泳显示产物条带大于预期,可能原因:①质粒模板可能没有完全线性化;②有义链3’端为突出结构;③RNA存在未完全变性的二级结构。

建议确认模板结构,并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。

Q2: RNA产物片段小于预期。

A2: 如果电泳显示产物条带小于预期大小,可能原因:①模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列;②模板中GC含量高形成高级结构;③RNase污染。

不同的聚合酶识别不同的终止序列,若含是模板中含终止结构,建议尝试不同的RNA聚合酶。如果模板为高GC,建议加入SSB蛋白,以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致,请跑变性胶检测产物。

Q3:产物电泳拖尾现象。

A3: 电泳过程中有拖尾现象,可能原因:①实验操作过程被RNA酶污染;②DNA模板被RNase污染。体系中的RNA酶抑制剂只能抑制痕量的RNA酶残留,建议重新纯化模板DNA,并在实验过程中使用RNase-free的枪头和EP管,佩戴一次性乳胶手套和口罩,所有试剂均用RNase-free H2O配制。

Q4:模板中间有一段Poly T中止序列,后面的序列可以转录出来吗?

A4:模板中有发卡结构会影响转录,序列一般不会影响转录。

Q5:使用TR101时的模板一定要是双链吗?

A5:至少T7启动子要是双链的。

Q6:合成的RNA如何纯化?是否有配套的过柱纯化盒子?

A6:我们没有配套的过柱纯化盒子。建议选择使用磁珠纯化。

Q7:体外转录试剂盒可以转录100bp的片段吗?

A7:只要模板如下图所示,可以转录。如果没有GGG,转录效率会很低。

Q8:使用线性化的质粒时,线性化质粒的方法有哪些?

A8:酶切(注意选择酶切位点时不要选择3’端突出的酶切位点)、反向PCR(得到的就是PCR产物)。

Q9:使用质粒作为模板时,在线性化的过程中,为什么需要使用平末端或者5’突出末端的限制性内切酶进行线性化?

A9:原因和环状质粒为模板相似,都是会因为没有终止子而无限循环下去,从而导致生成的产物片段大小不一。

Q10:sgRNA条带模糊。

A10:sgRNA是100nt左右的单链RNA,在水溶液中容易形成二级结构,因此电泳时会位置会发生变化,采用加速冷冻或者甲酰胺变性凝胶电泳可以改善电泳结果。

Q11:体外转录试剂盒适用的片段范围是多少?

A11:最小做过21bp的siRNA(TR102),最大做过10kb。

Q12:针对大片段和小片段,转录的效率如何?

A12:大片段会出现条带弥散的情况,因为片段越长酶越容易从模板上脱落,所以得到的产物条带就不是那么集中,其他竞品公司的产品也会出现类似的情况。短的模板小于300nt的,较短的转录其实对反应有抑制作用,所以要适当延长反应时间,可以过夜16h。因为模板和酶进行结合时识别启动子的过程需要时间,所以模板太短时会对反应造成抑制作用,同时建议增加模板量至2μg。

Q13:模板中存在高级结构(高GC或是茎环结构),怎么做可以提高产量?

A13:提高温度,如果有很多高级结构存在可以建议加入SSB蛋白。

Q14:模板中存在类似于T7终止序列(也是一种茎环结构)怎么做可以提高产量?

A14:降低反应温度。

Q15:产物纯化方式比较。

A15:酚/氯仿抽提的优点是便宜,但是有可能会残留游离的核苷酸。柱提法优点可以将游离的核苷酸去除干净,但价格相对较贵。切胶回收的方法得到的产物更加均一。磁珠法优点是快速且回收效率高,可达到90%以上。

Q16:得到的产物量无法达到说明书说的100-150ug可能的原因及建议。

A16:(1) 产物长度小于300nt时,建议提高产物的投入量至2μg,适当延长反应时间。

(2) 阳性对照,试剂盒中提供的阳性模板大小在500bp左右,对于阳性对照的实验设计可以在选择反应2h后从20μl的体系中取出5-10μl确定产量,剩下的体积继续反应至实验组的反应时间相同后确定产量。

(3) 不同的纯化方式产生的损失是不同的。

(4) 可以重新纯化模板。

(5) 确定模板定量以及其完整性。

(6) 尝试其它的启动子和RNA聚合酶。

Q17:TR101可以用于合成mRNA吗?

A17:可以,但是要自己购买帽子类似物,说明书中提供的加帽RNA体系就是合成mRNA的体系,里面GTP和加帽类似物的浓度比例建议为1:4。

Q18:模板投入量增加为2μg时,NTP的量以及DNA酶的量是否需要调整?

A18:模板投入量增加为2μg时,NTP的量不用调整,若担心模板消化不彻底,可将DNA酶的量从1μl提高至3μl;

Q19:对照组投入0.5μg产出是多少?

A19:Control Template的长度约500bp,投入0.5μg,产出约150-200μg,最低130μg(转录后直接用Qubit测量浓度)。

暂未实现,敬请期待
暂未实现,敬请期待
货  号
EN301-01/02
货  号
EN303-01/02
货  号
TR102-01/02