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T7 RNAi Transcription Kit

货  号:
TR102-01/02
价  格:
¥
1350.00
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T7 RNAi Transcription Kit

用于体外dsRNA 合成

可以转录siRNA和长片段dsRNA;

产量高达20-80 μg;

RNA磁珠可快速高效的纯化转录产物

图1.  500 bp dsRNA 2%琼脂糖凝胶电泳图

1:DL2000 Plus DNA Marker;2和4:500 bp dsRNA酶解前后产物(双端转);3和5:  500 bp dsRNA酶解前后产物(混合转)。

图2.  siRNA 12% PAGE电泳检测结果

1:siRNA转录产物;2:siRNA转录双酶消化产物;3:单链模板;4:双链退火模板

图3. siRNA干扰绿色荧光蛋白表达

左图为GFP质粒与negative control GFP siRNA共转染24 h后的293T细胞;右图为GFP质粒和positive GFP siRNA共转染24 h后的293T细胞。

T7 RNA ploymerase可识别带有T7启动子的DNA模版,以四种NTP 为底物,体外转录合成RNA。T7 RNAi Transcription Kit 是在T7 High Yield RNA Transcription Kit 基础上为转录双链RNA 而设计优化的版本,可用于转录21 bp 的siRNA 和长片段的dsRNA。转录产物经纯化后可用于阳离子脂质体、磷酸钙共沉淀、电穿孔、DEAE- 葡聚糖及显微注射等方法介导的RNAi 实验。一般情况下,一个反应可产生20 μg-80 μg 的RNA。

 

组分

TR102-01(25 rxn)

TR102-02(50 rxn)

Box 1

T7 Enzyme Mix

50 μl

100 μl

10 × Transcription Buffer

50 μl

100 μl

10 × Annealing Buffer

250 μl

500 μl

NTP Mix

200 μl

400 μl

DNase I

25 μl

50 μl

RNase T1(100 U/μl)

25 μl

50 μl

RNase T1 Dilution Buffer

300 μl

600 μl

Control Template*

5 μl

10 μl

Box 2

RNase-free H2O

5 ml

5 ml

RNA Clean Beads

2 ml

4 ml

* 本试剂盒提供的Control Template 为500 bp 双端含T7 启动子的PCR 产物,浓度为0.5 μg/μl。

Box 1 于-20℃保存,Box 2 于4℃保存。

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:RNA产物片段大于预期

A1: 如果电泳显示产物条带大于预期,可能原因:①质粒模板可能没有完全线性化;②有义链3’端为突出结构;③RNA存在未完全变性的二级结构。

建议确认模板结构,并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。

Q2:RNA产物片段小于预期

A2: 如果电泳显示产物条带小于预期大小,可能原因:①模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列;②模板中GC含量高形成高级结构;③RNase污染。

不同的聚合酶识别不同的终止序列,若含是模板中含终止结构,建议尝试不同的RNA聚合酶。如果模板为高GC,建议加入SSB蛋白,以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致,请跑变性胶检测产物。

Q3:合成的模板长度为50bp,反应的时间是多久。

A3:建议使用4h,产量应该足够。过夜也可,但产量不会多很多。

Q4: 产物电泳拖尾现象。

A4: 电泳过程中有拖尾现象,可能原因是模板投入量较多或者两个模板不以1:1投入而导致模板或者单链RNA酶解不彻底,建议适当延长双酶解时间。模板与单链RNA在总的转录产物中含量极低,一般不会影响后续实验。

Q5:siRNA模板链设计。

A5:siRNA由于转录模板比较短,所以通常采用化学合成的方式得到四条单链DNA模板,再两两退火成转录模板。siRNA 3’端带有两个游离碱基,推荐在设计模板时在模板链3’端加两个A碱基。siRNA的模板链包含:6个碱基的增强子、20个碱基的T7启动子、19-21个碱基的目标序列及2个游离的T碱基。

暂未实现,敬请期待
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货  号
TR101-01/02
货  号
EN301-01/02
货  号
EN303-01/02