VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina

Q1：FFPE样本是否可以用该试剂盒建库？

A1：FFPE样本中的mRNA会有一定降解，完整度较差，建议使用VAHTS^TM  Total RNA-seA (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina^®（ Vazyme #NR603）试剂盒进行文库构建。

Q2：收到试剂盒后，误将NR1放置 -20 ℃保存，是否还可以继续使用？

A2：低温会破坏磁珠，不可再继续使用。可另行采购对应模块VAHTS^TM mRNA Capture Beads(Vazyme #N401)。

Q3：关于在进行Agilent 2100 Bioanalyzer、Qubit 及qPCR检测时，高产量文库出现过度扩增的解释。

A3：高产量文库通常会出现不同程度的过度扩增现象。因为在文库扩增后期，通常引物被最先耗尽，大量文库片段在无法结合到引物的情况下，片段之间通过不完全匹配关系退火结合，从而形成部分双链+部分单链的杂合链，且片段更大。根据不同检测方式的对应原理，过度扩增产物在Agilent 2100 Bioanalyzer峰型中表现为upper marker之后有轻微翘尾；在Qubit 测定时，单链部分不计入有效浓度，但在APCR过程单链能够被有效测定，因此表现为Qubit 测定浓度低于qPCR定量浓度约10%-50%，但以上现象均属正常，不影响文库测序和数据分析。

Q4：本试剂盒是否适合用于small RNA文库制备？

A4：不适用。因为small RNA的长度仅为22 nt左右，而本试剂盒中磁珠抓取片段最低为100bp以上，无法有效富集到small RNA片段。

Q5：文库进行Agilent 2100 Bioanalyzer质检，发现产生双峰，产生的原因？

A5：（1）RNA有杂质残留，建库过程中发生降解，到PCR步骤前的有效模板量低，PCR时由于模板不足发生了非特异性扩增。建议将RNA样品在65℃条件下加热15 min，检测是否降解，如果确实为RNA的问题则需要重新提取RNA。

（2）物种本身比较特殊，RNA打断后片段不是连续且均一的分布，做分选方案时可能分选到了两个范围的片段。

（3）特殊物种的mRNA丰度较低，PCR的有效模板较低。建议加大投入量或者做重复样品到二链合成后的纯化步骤合并在一起。