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VAHTS Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina

科学研究试剂

高通量测序文库构建试剂

药物研发试剂

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    2020-06-30 00:09:29
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VAHTS Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina

去除核糖体rRNA,适合lncRNA分析VAHTSTM TotalRNA-seq(H/M/R)LibraryPrepKitforIllumina®● 包含Ribo-OffTM rRNAdepletionmodule, 可去除人、小鼠、大鼠、牛、狗、马、鸡、猴、猪、斑马鱼等物种的核糖体RNA● 链特异性建库 ● 优化的大片段建库方案 图1.Ribo-OffTM模块去除rRNA原理示意图。图2.使用R
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VAHTS® Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina®

去除核糖体rRNA,适合lncRNA分析

包含Ribo-Off® rRNA depletion module, 可去除人、小鼠、大鼠、牛、狗、马、鸡、猴、猪、斑马鱼等物种的核糖体RNA

链特异性建库

优化的大片段建库方案

图1. Ribo-Off®模块去除rRNA原理示意图。

图2. 使用Ribo-Off®模块去除rRNA总共耗时不超过2小时,其中操作时间仅需10分钟以内。

图3. 1 μg universal human reference RNA分别用Oligo dT磁珠纯化mRNA或者用Ribo-Off®模块去除rRNA后构建文库,用Hiseq 2500测序。数据与人类基因组数据库hg19进行比对。可以看到, Ribo-Off®模块可以更有效地去除rRNA,并可保留更多的非编码RNA信息。

VAHTS® Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina®适用于起始模板为0.1-1 μg的人、小鼠、 大鼠总RNA的链特异性转录组文库构建。与常规mRNA-seq文库构建不同的是,本试剂盒将rRNA (包括细胞质28S, 18S, 5S rRNA以及线粒体12S, 5.8S rRNA)从总RNA中去除,保留mRNA以及其它非编码RNA,可用于lncRNA等非编码RNA的分析。降解的RNA样本也可用本试剂盒进行文库构建。 在第二链cDNA合成时,掺入dUTP标记第二链; PCR前将标记的第二链模板用UDG酶消化,使得最终的测序信息都来自于第一链cDNA,从而保留了RNA的链方向性。测序后的数据分析可确定转录本是来自正义还是反义DNA链。

所有组分均在-20°C保存。

适用范围

起始模板:0.1–1 μg人、小鼠、大鼠总RNA。

转录本信息:

本试剂盒适合于针对mRNA和所有除rRNA以外的非编码RNA的链特异性RNA-seq分析,包括基因表达、单核苷酸变异 (single nucleotide variation),可变剪切/融合基因、目标转录组分析等。

关键词:
VAHTS Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina®
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Q1:FFPE样本是否可以用该试剂盒建库?

A1:可以。FFPE样本中的mRNA会有一定降解,完整度较差,但本试剂盒不是通过Oligo dT抓取mRNA片段,因此适合FFPE样品的文库构建。不同程度降解的FFPE样本(或其他降解RNA样本)的实验方案详见NR603说明书-FFPE样本或其他降解样本处理说明(Page 18)。

Q2:文库扩增最高可以使用多少个循环?

A2:经过大量研发测试,15个循环数为最佳条件,一般不建议更改;如需调整,建议先取1 μl样品进行Qubit®检测后酌情再补1-2个循环,最多不超过17个循环。

Q3:LncRNA建库怎么建?

A3:LncRNA的建库一般采用去rRNA 的方式,但得到的RNA有三种,mRNA,LncRNA,CircRNA,如果只需要LncRNA的数据,再单独拿出来分析。同时建库过程中应注意梯度降温的程序。

Q4:客户提取的RNA有基因组DNA污染。用RNA磁珠纯化后,RNA降解,但是DNA没有被去除,后续操作有什么建议?

A4:RNA纯化磁珠不能将DNA降解。如果量多的话,可以用DNaseI消化,然后用RNA磁珠纯化;如果DNA量少的话,建库过程中,采用DnaseI降解探针的过程中,可以去除基因组DNA的污染。

Q5:如果文库浓度过低,可以从哪些角度去寻找原因并如何改进?

A5:以高质量的RNA样品为模板构建得到的文库浓度都能达到上机测序要求,如果无法提供合格的RNA样品,可尝试使用以下方法弥补:

(1)起始量:提高样品起始量,最大可做到10 μg;

(2)做几个重复的样品,到二链合成纯化步骤合并在一起,或做到文库扩增前合并在一起;

(3)做不分选方案:94°C 8 min打断条件下RNA片段虽然偏小,但是分布会很集中,均一性也较好,有些个性化样品会出现打断不均一、某些大小的片段较多,经过PCR更明显,出现刺峰,这种情况在不分选方案中出现很少。

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