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    2020-06-30 00:08:57
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VAHTS mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina

常规转录组建库VAHTSTM mRNA-seqv2LibraryPrepKitforIllumina®图1.选择1μg或100ng人胚肾上皮细胞HEK293总RNA、水稻幼苗总RNA、桃果实总RNA,用VAHTSTM mRNA-seqv2LibraryPrepKitforIllumina®分别构建插入片段大小为200-300bp或150-200bp的转录组文库。文库用Agilent2100Bioa
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说明书

VAHTS® mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina

常规转录组建库

对于复杂植物模板具有很高的成功率

建库流程与Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2相同

优化的大片段建库方案

测序数据与Illumina试剂具有高度的一致性

图1. 选择1 μg 或100 ng人胚肾上皮细胞HEK293总RNA、水稻幼苗总RNA、桃果实总RNA,用VAHTS® mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina分别构建插入片段大小为200-300 bp或150-200 bp的转录组文库。文库用Agilent 2100 Bioanalyzer进行分析。

表1. 1 μg 或100 ng universal human reference RNA分别用VAHTS® mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina以及Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2构建文库。文库用Qubit定量后,按照相同浓度混样,用Hiseq 2500测序。可以看到,用Vazyme试剂盒构建的文库具有和Illumina非常近似的数据产出和数据质量。

图2. 1 μg (A)或100 ng (B) universal human reference RNA分别用VAHTS® mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina以及Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2构建文库,用Hiseq 2500测序,分析数据均一性分布。可以看出,本产品构建的文库数据分布均匀,没有5’或3’偏好性,并且和Illumina试剂盒高度一致。

图3. 1 μg 或100 ng universal human reference RNA分别用VAHTS® mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina以及Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2构建文库,用Hiseq 2500测序,两两比较表达重复相关性,以spearman相关系数r表示。可以看出,1 μg (A)、100 ng (B)模板量下Vazyme VAHTS®和Illumina TruSeq之间,以及用Vazyme VAHTS®建库1 μg和100 ng之间 (C)的相关系数r均大于0.97,说明具有很高的表达重复相关性。

 VAHTS® mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina适用于起始模板为0.1-1 μg总RNA的Illumina平台转录组文库构建。本产品的模板适应性广泛, 对于植物样本具有很高的建库成功率。本产品不仅提供与Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2相同的建库流程 (插入片段150-200 bp),还针对插入片段大于200 bp的文库提供优化的打断及分选条件。用本产品构建的文库在数据产出及数据质量上均与Illumina官方试剂盒保持高度的一致性。

  组分 NR601-01(24 rxn) NR601-02(96 rxn)
NR 1 mRNA Capture Beads 1.2 ml 4.8 ml
Beads Binding Buffer 1.2 ml 4.8 ml
Beads Wash Buffer 9.6 ml 38.4 ml
Tris Buffer 1.2 ml 4.8 ml
NR 2 Frag/Prime Buffer 468 μl 2 × 936 μl
1st Strand Buffer 144 μl 576 μl
1st Strand Enzyme Mix 48 μl 192 μl
2nd Strand Buffer 480 μl 2 × 960 μl
2nd Strand Enzyme Mix 120 μl 480 μl
NR 3 End Prep Mix 960 μl 4 × 960 μl
dA-Tailing Buffer Mix 240 μl 960 μl
dA-Tailing Enzyme Mix 60 μl 240 μl
Ligation Mix 60 μl 240 μl
Stop Ligation Mix 120 μl 480 μl
PCR Primer Mix 120 μl 480 μl
Amplification Mix 1 600 μl 4 × 600 μl

Box 1: 2-8°C保存。

Box 2 :-20°C保存。

Box 3 :-20°C保存。

适用范围

起始模板:0.1–1 μg完整度良好的总RNA。建议用Agilent 2100 Bioanalyzer对提取的总RNA进行质控,RIN值应≥8。不完整或降解的总RNA模板会给测序结果带来3’偏好性。

转录本信息:本试剂盒适合于针对mRNA的RNA-seq分析,包括:基因表达、单核苷酸变异 (single nucleotide variation),可变剪切/融合基因、目标转录组分析等。如果需要分析非编码RNA,请选择VAHTS® Total RNA-seq Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #NR603)。

关键词:
VAHTS mRNA-seq v2 Library Prep Kit for Illumina®
NR601-01/02
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Q1:FFPE样本是否可以用该试剂盒建库?

A1:FFPE样本中的mRNA会有一定降解,完整度较差,建议使用VAHTS® Total RNA-seA (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina®( Vazyme #NR603)试剂盒进行文库构建。

Q2:收到试剂盒后,误将NR1放置 -20 ℃保存,是否还可以继续使用?

A2:低温会破坏磁珠,不可再继续使用。可另行采购对应模块VAHTS® mRNA Capture Beads(Vazyme #N401)。

Q3:关于在进行Agilent 2100 Bioanalyzer、Qubit 及qPCR检测时,高产量文库出现过度扩增的解释。

A3:高产量文库通常会出现不同程度的过度扩增现象。因为在文库扩增后期,通常引物被最先耗尽,大量文库片段在无法结合到引物的情况下,片段之间通过不完全匹配关系退火结合,从而形成部分双链+部分单链的杂合链,且片段更大。根据不同检测方式的对应原理,过度扩增产物在Agilent 2100 Bioanalyzer峰型中表现为upper marker之后有轻微翘尾;在Qubit 测定时,单链部分不计入有效浓度,但在APCR过程单链能够被有效测定,因此表现为Qubit 测定浓度低于qPCR定量浓度约10%-50%,但以上现象均属正常,不影响文库测序和数据分析。

Q4:本试剂盒是否适合用于small RNA文库制备?

A4:不适用。因为small RNA的长度仅为22 nt左右,而本试剂盒中磁珠抓取片段最低为100bp以上,无法有效富集到small RNA片段。

Q5:文库进行Agilent 2100 Bioanalyzer质检,发现产生双峰,产生的原因?

A5:(1)RNA有杂质残留,建库过程中发生降解,到PCR步骤前的有效模板量低,PCR时由于模板不足发生了非特异性扩增。建议将RNA样品在65℃条件下加热15 min,检测是否降解,如果确实为RNA的问题则需要重新提取RNA。

(2)物种本身比较特殊,RNA打断后片段不是连续且均一的分布,做分选方案时可能分选到了两个范围的片段。

(3)特殊物种的mRNA丰度较低,PCR的有效模板较低。建议加大投入量或者做重复样品到二链合成后的纯化步骤合并在一起。

 

这是描述信息
VAHTS DNA Clean Beads
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