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    2020-06-30 00:05:30
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Discover-sc WTA Kit V2

Discover-scWTAKitV2单细胞转录组测序文库构建最佳搭档模板起始量低:单个细胞或10pgTotalRNA即可作为起始模板,进行高效扩增扩增灵敏度高:使用LNA技术及精心优化的反应体系,大幅度增加了低表达基因的检出量产物完整性好:通过双端引物扩增全长cDNA,获得全转录组信息,避免了5'和3'偏好性操作成功率大:大大减少了RNA样品的处理,从而最大限度避免了样品损失的风险,提高了操作成
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Discover-sc® WTA Kit V2

单细胞转录组测序文库构建最佳搭档

模板起始量低:单个细胞或10pg Total RNA即可作为起始模板,进行高效扩增

扩增灵敏度使用LNA技术及精心优化的反应体系,大幅度增加了低表达基因的检出量

产物完整性好:通过双端引物扩增全长cDNA,获得全转录组信息,避免了5'和3'偏好性

操作成功率大:大大减少了RNA样品的处理,从而最大限度避免了样品损失的风险,提高了操作成功率

体积兼容性广:样品兼容体积可高达5 μl,兼容不同浓度的模板进行扩增 

1.模板起始量低,扩增产物cDNA完整性好

10 pg 293T细胞Total RNA用Discover-sc® WTA Kit V2进行扩增,取1 μl cDNA扩增产物用Agilent 2100 Bioanalyzer进行分析。试剂盒以Oligo dT Primer为逆转录引物,并利用Discover-sc® Reverse Transcriptase的Template-switching活性在cDNA的3’端添加一段接头序列,通过该接头序列进行后续的PCR扩增,获得全长cDNA扩增产物,同时避免了rRNA的污染。

 

2.文库质量分析—数据基本指标

Vazyme-1和Vazyme-2是单个293T细胞经过Discover-sc® WTA Kit V2 进行扩增,C-1和C-2是单个293T细胞经过用C公司单细胞转录组试剂盒进行扩增,取1 ng cDNA扩增产物经TruePrep® DNA Library Prep Kit V2 for Illumina构建文库。以下均为此文库数据分析。

 

3.基因表达总体情况分析

Discover-sc® WTA Kit V2试剂盒扩增产物检测灵敏度高,单个293T细胞检测到基因数高达15000个。

 

4.数据分布均一,无偏好性

左图为Vazyme-1测序片段在基因上的分布结果,右图为C-1测序片段在基因上的分布结果,数据显示Discover-sc® WTA Kit V2扩增很好的保证了基因5’和3’的覆盖。

 

5.表达重复相关性高

左图为Vazyme-1和Vazyme-2表达重复相关性分析,右图为C-1和C-2表达重复性相关性分析。数据结果表明表达重复相关性高于C公司。

 Discover-sc® WTA Kit V2能以1-1000个细胞或10 pg-10 ng总RNA为模板,通过第一链cDNA合成及扩增,获取足够的用于序列分析的样本,从而解决了诸如单细胞等微量样本因RNA含量过低导致的无法使用常规mRNA-seq进行测序分析的技术难题。试剂盒以Oligo dT Primer为逆转录引物进行cDNA合成,并利用Discover-sc® Reverse Transcriptase的Template-switching活性在cDNA的3’端添加一段接头序列,通过该接头序列进行后续的PCR扩增,获得全长cDNA扩增产物,有效避免了cDNA合成过程中的3’偏好性和rRNA的污染。

      Discover-sc® WTA Kit V2是在Discover-sc® WTA Kit基础上开发的升级版本,其检测灵敏度、体积兼容性均得到了大幅度提升,更加适合低丰度基因及低浓度模板的检测。

Box 1,-70°C储存; Box 2,-20°C储存。

关键词:
Discover-sc WTA Kit V2
单细胞转录组测序文库构建最佳搭档
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Q1:单细胞转录组扩增时,在获得单细胞后不立即进行扩增,细胞该如何保存?

A1:可以将细胞放入裂解液后于-70℃保存一段时间,但是不建议存放时间过长。

Q2:单细胞转录组扩增出现小片段,可能原因有哪些?

A2:(1)样本出现降解,即取样前细胞已死亡,可尝试重新准备样品;

(2)样本中引入抑制组分,如:胰酶、台盼蓝、高浓度的EDTA、巯基乙醇等。可尝试将细胞在PBS中多清洗重悬几次以解除抑制,或参照3情况解决;

(3)内源性RNA酶过多,在细胞裂解过程中将RNA降解,常见于免疫细胞或一些特殊的组织中。可在加入细胞样本前,在裂解液中加入1%巯基乙醇,用RNA磁珠纯化后再继续进行后续实验。

Q3:RNA样本能否使用N711进行扩增?

A3:RNA进行扩增前,要进行质检。这是因为N711试剂盒只针对带有3’poly(A)的转录本进行扩增。如果RNA质量完整度不好,会丢失5’转录本的信息。如果RNA质量较好,可以使用N711。

Q4:单细胞转录组扩增后,cDNA两端的扩增引物会占用测序读长,怎样去除?

A4:可将单细胞转录组扩增与转座酶建库搭配使用。这是因为单细胞转录组扩增后会在cDNA 的3’和5’端分别引入锚定序列,而转座酶建库会丢失一部分cDNA的3’和5’端序列,这样就能实现cDNA两端的扩增引物的去除,提高测序覆盖度。

Q5:单细胞转录组扩增后,产物浓度过低,怎样改善?

A5:不同的细胞样本其RNA含量不同,可通过增加扩增循环数来改善。比如免疫细胞,其RNA含量一般比较少,可根据已测试的结果进行循环数的调整。

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VAHTS DNA Clean Beads
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