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TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit

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A111-01/02/03
价  格:
¥
1580.00
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TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit

绿色荧光检测凋亡

经过优化FITC-12-dUTP 与未标记dNTP 的比例,提高了荧光检测的信噪比和灵敏度

高活性的重组TdT 酶保证荧光掺入效率

适用于细胞爬片、石蜡切片和冰冻切片

图1. 果蝇三龄幼虫视盘(eye disc)

凋亡诱导基因Hid 在特异性启动子驱动下在果蝇视盘的远端诱导出大量凋亡细胞。A. TUNEL 染色,标记凋亡细胞。B. ELAV 染色,标记所有的感光细胞。C. Merge

图2. 人睾丸组织切片经DNase I 处理

A. TUNEL染色,标记凋亡细胞。B. PI染色,标记所有细胞核。C. Merge。

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA 被内源核酸内切酶有规律的降解成长度约为180 bp-200 bp 的整倍数的片段。本试剂盒采用TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT) 在凋亡细胞断裂的DNA的3’- 羟基(3’-OH) 末端催化掺入荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP)。FITC-12-dUTP 标记的DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。试剂盒对标记反应进行了优化,采用最佳比例的FITC-12-dUTP 和未标记dNTP 进行3’-OH 末端的核苷酸掺入,使得同一个断裂的DNA 片段末端可以形成更长的“标记尾巴”。该“标记尾巴”减少了相邻掺入dNTP 上标记基团的空间位阻,增加每个断裂片段上的荧光基团数目,降低荧光基团相邻后可能造成的聚集和淬灭,从而提高检测灵敏度,减少非特异性反应。

经过优化FITC-12-dUTP 与未标记dNTP 的比例,提高了荧光检测的信噪比和灵敏度,高活性的重组TdT 酶保证荧光掺入效率,适用于细胞爬片、石蜡切片和冰冻切片。

组   分

  A111-01 (20 rxn)    

A111-02 (50 rxn)        

A111-03 (100 rxn)

5 × Equilibration Buffer 

1.25 ml  

1.25 ml × 2

1.25 ml × 3

FITC-12-dUTP Labeling Mix

100 μl     

250 μl

250 μl × 2

Recombinant TdT Enzyme

20 μl

50 μl

50 μl × 2

Proteinase K (2 mg/ml)    

40 μl     

100 μl      

100 μl × 2

DNase I (2 U/μl)      

5 μl  

13 μl  

25 μl

10 × DNase I Buffer

100 μl 

260 μl 

500 μl

-20℃保存;FITC-12-dUTP Labeling Mix避光储存于-20℃。

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:细胞形态很模糊,荧光很少,背景值很高。

A1:(1) 延长细胞通透时间,操作过程中注意保持湿润,最后观察是加PBS润洗。

(2) 洗片过程中可以加Triton进行洗涤。

(3) 注意PI不要过曝,建议曝光时间1-5 s,稍微调低一点曝光。

(4) 尝试延长37℃孵育时间,剪一小片封口膜把液体盖上,防止干片。

(5) 同时做阴阳性对照排除试剂盒、操作手法和细胞本身的问题。

Q2:做免疫组化和TUNEL共染,结果不理想。

A2:建议实验中最后一步用PBS清洗,降低背景值,且操作过程中一定要保持样品干燥。

Q3:怎样区分非特异性和特异性染色。

A3:同时做阴性/阳性对照。

Q4:阳性做不出来。

A4:如果是难操作样本,推荐延长FITC染色时间至2小时,并进行拍摄参数优化。如果排除样本本身的问题,一般阳性做不出来主要有通透,阳性处理和标记孵育等方面出现问题。阳性处理中要注意Buffer用ddH2O稀释,酶要用buffer稀释,酶孵育时间10分钟。最好,再注意一下标记液是否配置正确,孵育的时候有没有干片等。

Q5:如何确定可检测样本范围?

A5:TUNEL检测的是晚期凋亡,所以只要有晚期凋亡,一般都可使用。

Q6: 在整个tunel实验中,是否可以中止实验,过夜处理?

A6: 建议不要中止,如果必须中止,标记结束后,放在4℃冰箱过夜处理。

Q7:细胞固定时将75 %乙醇错加成了100 %,样本是否可以使用?

A7:不能用,高浓度的乙醇会使细胞迅速皱缩,样本会迅速脱水,影响固定的效果。

Q8:高背景(如未凋亡细胞的强绿色荧光背景)或绿色荧光点不在背景染色范围。

A8:(1) 非特异性掺入FITC-12-dUTP。

处理方法:在操作过程中保持细胞湿润;标记反应完成,载玻片在用PBS洗一遍之后,可再用含0.1% Triton® X-100和5 mg/ml BSA的PBS洗3次,每次5 min。

(2) 脱蜡不彻底,FITC与蜡相结合,导致高背景

(3) 组织样本不干净,含有血液及脂肪等杂质,与FITC结合后形成高背景

Q9:阳性细胞数量少。

A9:通透不充分,可通过调整蛋白酶K或Triton® X-100的孵育时间优化通透步骤。

Q10:组织切片从载玻片上脱落。

A10:组织切片粘附之前的包被不充分。在展片之前,用3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane,TESPA;Sigma Cat.# A3648)包被显微镜载玻片比多聚赖氨酸(poly-L-lysine)效果更好。

Q11:显微镜或流式细胞仪分析只剩下很少的细胞。

A11:在操作过程中丢失大量细胞。①可以提高起始的细胞量;②在制备细胞悬液时,离心过程中用含1% BSA的PBS洗细胞。

Q12:标记率低。

A12:如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失),应用溶于1 ×PBS(PH7.4)中的4%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。过度的固定导致与蛋白过度交联也会导致标记效率低,可以适当缩短固定时间;或用溶于1 ×PBS(PH7.4)的2%多聚甲醛固定。

Yu W, Zhang Z, Min D, et al. (2014). Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 19 promotes osteosarcoma growth and metastasis and associateswith prognosis. Eur J Cancer, 50(6):1125-1136. IF:5.061
Xu C, Yu L, Hou J, et al. (2017).Conditional Deletion of PDK1 in the Forebrain Causes Neuron Loss and Increased Apoptosis during Cortical Development[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience, 2017, 11:330.IF:4.555
暂未实现,敬请期待
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