TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit_诺唯赞——用科技改善人类健康生活

TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit

绿色荧光检测凋亡

经过优化FITC-12-dUTP 与未标记dNTP 的比例，提高了荧光检测的信噪比和灵敏度

高活性的重组TdT 酶保证荧光掺入效率

适用于细胞爬片、石蜡切片和冰冻切片

图1. 果蝇三龄幼虫视盘(eye disc)

凋亡诱导基因Hid 在特异性启动子驱动下在果蝇视盘的远端诱导出大量凋亡细胞。A. TUNEL 染色，标记凋亡细胞。B. ELAV 染色，标记所有的感光细胞。C. Merge

图2. 人睾丸组织切片经DNase I 处理

A. TUNEL染色，标记凋亡细胞。B. PI染色，标记所有细胞核。C. Merge。

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA 被内源核酸内切酶有规律的降解成长度约为180 bp-200 bp 的整倍数的片段。本试剂盒采用TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，TdT) 在凋亡细胞断裂的DNA的3’- 羟基(3’-OH) 末端催化掺入荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP)。FITC-12-dUTP 标记的DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。试剂盒对标记反应进行了优化，采用最佳比例的FITC-12-dUTP 和未标记dNTP 进行3’-OH 末端的核苷酸掺入，使得同一个断裂的DNA 片段末端可以形成更长的“标记尾巴”。该“标记尾巴”减少了相邻掺入dNTP 上标记基团的空间位阻，增加每个断裂片段上的荧光基团数目，降低荧光基团相邻后可能造成的聚集和淬灭，从而提高检测灵敏度，减少非特异性反应。

经过优化FITC-12-dUTP 与未标记dNTP 的比例，提高了荧光检测的信噪比和灵敏度，高活性的重组TdT 酶保证荧光掺入效率，适用于细胞爬片、石蜡切片和冰冻切片。

组分	A111-01 (20 rxn)	A111-02 (50 rxn)	A111-03 (100 rxn)
5 × Equilibration Buffer	1.25 ml	1.25 ml × 2	1.25 ml × 3
FITC-12-dUTP Labeling Mix	100 μl	250 μl	250 μl × 2
Recombinant TdT Enzyme	20 μl	50 μl	50 μl × 2
Proteinase K (2 mg/ml)	40 μl	100 μl	100 μl × 2
DNase I (2 U/μl)	5 μl	13 μl	25 μl
10 × DNase I Buffer	100 μl	260 μl	500 μl

-20℃保存；FITC-12-dUTP Labeling Mix避光储存于-20℃。

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Q1：细胞形态很模糊，荧光很少，背景值很高。

A1：(1) 延长细胞通透时间，操作过程中注意保持湿润，最后观察是加PBS润洗。

(2) 洗片过程中可以加Triton进行洗涤。

(3) 注意PI不要过曝，建议曝光时间1-5 s,稍微调低一点曝光。

(4) 尝试延长37℃孵育时间，剪一小片封口膜把液体盖上，防止干片。

(5) 同时做阴阳性对照排除试剂盒、操作手法和细胞本身的问题。

Q2：做免疫组化和TUNEL共染，结果不理想。

A2：建议实验中最后一步用PBS清洗，降低背景值，且操作过程中一定要保持样品干燥。

Q3：怎样区分非特异性和特异性染色。

A3：同时做阴性/阳性对照。

Q4：阳性做不出来。

A4：如果是难操作样本，推荐延长FITC染色时间至2小时，并进行拍摄参数优化。如果排除样本本身的问题，一般阳性做不出来主要有通透，阳性处理和标记孵育等方面出现问题。阳性处理中要注意Buffer用ddH₂O稀释，酶要用buffer稀释，酶孵育时间10分钟。最好，再注意一下标记液是否配置正确，孵育的时候有没有干片等。

Q5：如何确定可检测样本范围？

A5：TUNEL检测的是晚期凋亡，所以只要有晚期凋亡，一般都可使用。

Q6: 在整个tunel实验中，是否可以中止实验，过夜处理？

A6: 建议不要中止，如果必须中止，标记结束后，放在4℃冰箱过夜处理。

Q7：细胞固定时将75 %乙醇错加成了100 %，样本是否可以使用？

A7：不能用，高浓度的乙醇会使细胞迅速皱缩，样本会迅速脱水，影响固定的效果。

Q8：高背景（如未凋亡细胞的强绿色荧光背景）或绿色荧光点不在背景染色范围。

A8：(1) 非特异性掺入FITC-12-dUTP。

处理方法：在操作过程中保持细胞湿润；标记反应完成，载玻片在用PBS洗一遍之后，可再用含0.1% Triton^® X-100和5 mg/ml BSA的PBS洗3次，每次5 min。

(2) 脱蜡不彻底，FITC与蜡相结合，导致高背景

(3) 组织样本不干净，含有血液及脂肪等杂质，与FITC结合后形成高背景

Q9：阳性细胞数量少。

A9：通透不充分，可通过调整蛋白酶K或Triton^® X-100的孵育时间优化通透步骤。

Q10：组织切片从载玻片上脱落。

A10：组织切片粘附之前的包被不充分。在展片之前，用3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane，TESPA；Sigma Cat.# A3648)包被显微镜载玻片比多聚赖氨酸(poly-L-lysine)效果更好。

Q11：显微镜或流式细胞仪分析只剩下很少的细胞。

A11：在操作过程中丢失大量细胞。①可以提高起始的细胞量；②在制备细胞悬液时，离心过程中用含1% BSA的PBS洗细胞。

Q12：标记率低。

A12：如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），应用溶于1 ×PBS(PH7.4)中的4%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。过度的固定导致与蛋白过度交联也会导致标记效率低，可以适当缩短固定时间；或用溶于1 ×PBS(PH7.4)的2%多聚甲醛固定。

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暂未实现,敬请期待

TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit

Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit