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Single Cell Sequence Specific Amplification Kit
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Single Cell Sequence Specific Amplification Kit

货  号:
P621-01
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¥
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Single Cell Sequence Specific Amplification Kit

用于单细胞或微量总RNA中转录组的扩增

适用于1-1000个细胞

一步法RT-PCR预扩增

最高可扩增500个靶基因

扩增产物适合用任何实时荧光定量PCR仪分析

高灵敏度,低成本

Single Cell Squence Specific Amplification Kit 是基于一步RT-PCR的扩增方法,实现单细胞或者微量总RNA中转录组的扩增,检测单个细胞之间不同基因的表达水平。本试剂盒实现了细胞裂解、RNA逆转录和PCR反应在同一管内完成,不需要额外的移管操作,具有节约时间、减少实验误差、降低污染、提高灵敏度等优势。

组分 P621-01 (200 rxn)
2 × Reaction Mixa 500 μl
RT/Taq enzymeb 20 μl
Nuclease-free ddH2 O 2 × 1.25 ml

-30 ~ -15℃保存。-20 ~ 0℃运输。

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:1.5μl反应体系加入多少样本的体积?

A1:5μl的反应体系下,加入的样本体积最好不要超过0.5μl,如果样本体积较大,建议适当增大反应体系。

Q2:整个体系能否减半?

A2:可以,但是不建议,一步法体系较为复杂,大体系做效果更好。

Q3:真的可以适用于一个细胞的定量吗?检测的基因数量最多可以达到多少?会不会造成扩增偏好性?

A3:单细胞是可以的,亦可用于2-1000 cells或10 pg-100 ng RNA的样品;最多可混合500对不同基因的扩增引物;关于扩增偏好性,只要根据细胞数控制好循环数,不会造成偏好性。

Q4:样本不是分散开的细胞,而是一小块组织,可不可以用呢?组织是否可用裂解液进行裂解细胞?

A4:可以的,但是组织块不能太大,大约有几十个细胞量的组织块是可以的,但是超过这个范围,目前还没有案例。该产品反应体系只有5μl,不兼容细胞裂解液,大量的裂解液会影响反应的进行,可以将组织进行液氮速冻,直接投入到反应体系即可。

Q5:引物可以使用Oligo dT或随机引物吗?

A5:不可以,因为该产品是RNA提取纯化、逆转录和PCR反应在同一管内完成,如果使用Oligo dT或随机引物无法达到预扩增的目的。

Q6:引物设计有何要求。

A6:(1) 除了要符合常规的PCR引物设计要求外,还要注意区分外显子和内含子。

(2) 如果引物池存在2对以上的引物时,退火温度建议都是60℃左右。

Q7:逆转录时间设置为60 min,时间太长,是否可以缩短?退火、延伸这一步骤15 min,循环数20,可以把延伸时间和循环数调节一下?

A7:逆转录时间与扩增的基因数目也有关,最保险的是使其进行充分的逆转录,60 min可以保证充分逆转。延伸时间可以根据后期要测试的基因数量进行调节,这里设置的15 min,是为了彻底逆转500个基因,后续客户可根据细胞/RNA投入量进行调节;循环数20也是可以根据样本细胞量进行调节的。

Q8:PCR预扩增结束后的产物先稀释了5倍,然后再稀释10倍,为什么要这样做呢?为什么不一步稀释到位呢?低丰度,高丰度的基因都是稀释50倍吗?

A8:稀释5倍是作为储存液,再稀释10倍作为工作液。稀释的倍数是可以根据基因的表达量和样本量进行调整的,所以最好提前做个预实验判断一下。

Q9:配置好RT-PreAmp Master Mix后,冰上可以放置多长时间?

A9:放置时间越短越好,我们测试过冰上放置5 min左右没有问题。

 

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