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    2020-07-01 00:01:04
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TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit

TUNELBrightRedApoptosisDetectionKit更亮、更稳定的红色荧光专利的Bright因子,使得荧光更亮,抗淬灭能力更强标记红色荧光,便于与GFP等其它绿色荧光共标记高活性的重组TdT酶保证荧光掺入效率适用于细胞爬片、石蜡切片和冰冻切片图1.人肝细胞WRL-68阳性处理后产生的凋亡。A.TUNELBrightRed染色,箭头所指为凋亡细胞。B.Merge,蓝色为DAPI标记
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A113-01/02/03
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说明书

TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit

更亮、更稳定的红色荧光

专利的Bright 因子,使得荧光更亮,抗淬灭能力更强

标记红色荧光,便于与GFP 等其它绿色荧光共标记

高活性的重组TdT 酶保证荧光掺入效率

适用于细胞爬片、石蜡切片和冰冻切片

图1. 人肝细胞WRL-68 阳性处理后产生的凋亡。A. TUNEL BrightRed 染色,箭头所指为凋亡细胞。B. Merge,蓝色为DAPI标记所有细胞。

本试剂盒采用TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)在凋亡细胞断裂的DNA 的3’- 羟基(3’-OH) 末端催化掺入四甲基罗丹明- 脱氧三磷酸尿苷(TMR red-dUTP)。试剂盒对标记反应进行了优化,采用最佳比例的TMR red-dUTP 和未标记dNTP 进行3’-OH 末端的核苷酸掺入,使得同一个断裂的DNA 片段末端可以形成更长的“标记尾巴”。该“标记尾巴”减少了相邻掺入dNTP上标记基团的空间位阻,增加每个断裂片段上的荧光基团数目,降低荧光基团相邻后可能造成的聚集和淬灭,从而提高检测灵敏度,减少非特异性反应。试剂盒中的BrightRed Labeling Mix 包含TMR red-dUTP 以及专利的Bright 因子。这种独特的小分子化合物可与TMR red 非共价结合,增强其稳定性,并使其信号放大,从而使标记物更亮,抗淬灭能力更强。

组   分

  A113-01 (20 rxn)   

A113-02 (50 rxn)

A113-03 (100 rxn)

5 × Equilibration Buffer

1.25 ml

1.25 ml × 2

1.25 ml × 3

BrightRed Labeling Mix

100 μl

250 μl

250 μl × 2

Recombinant TdT Enzyme

20 μl

50 μl

50 μl × 2

Proteinase K (2 mg/ml)

40 μl

100 μl

100 μl × 2

DNase I (2 U/μl)

5 μl

13 μl

25 μl

10 × DNase I Buffer

100 μl

260 μl

500 μl

-20℃储存;BrightRed  Labeling Mix避光储存于-20℃。

关键词:
TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit
标记红色荧光
细胞凋亡检测
未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:细胞形态很模糊,荧光很少,背景值很高。

A1:(1) 延长细胞通透时间,操作过程中注意保持湿润,最后观察是加PBS润洗。

(2) 洗片过程中可以加Triton进行洗涤。

(3) 注意PI不要过爆,建议曝光时间1-5 s,稍微调低一点曝光。

(4) 尝试延长37℃孵育时间,剪一小片封口膜把液体盖上,防止干片。

(5) 同时做阴阳性对照排除试剂盒、操作手法和细胞本身的问题。

Q2:怎样区分非特异性和特异性染色。

A2:同时做阴性/阳性对照。

Q3:阳性做不出来。

A3:如果是难操作样本,推荐延长FITC染色时间至2小时,并进行拍摄参数优化。如果排除样本本身的问题,一般阳性做不出来主要有通透,阳性处理和标记孵育等方面出现问题。阳性处理中要注意Buffer用ddH2O稀释,酶要用buffer稀释,酶孵育时间10分钟。最好,再注意一下标记液是否配置正确,孵育的时候有没有干片等。

Q4:如何确定可检测样本范围?

A4:TUNEL检测的是晚期凋亡,所以只要有晚期凋亡,一般都可使用。

Q5: 在整个tunel实验中,是否可以中止实验,过夜处理?

A5: 建议不要中止,如果必须中止,标记结束后,放在4℃冰箱过夜处理。

Q6:细胞固定时将75 %乙醇错加成了100 %,样本是否可以使用?

A6:不能用,高浓度的乙醇会使细胞迅速皱缩,样本会迅速脱水,影响固定的效果。

Q7:高背景(如未凋亡细胞的强绿色荧光背景)或绿色荧光点不在背景染色范围。

A7:(1) 非特异性掺入FITC-12-dUTP。

处理方法:在操作过程中保持细胞湿润;标记反应完成,载玻片在用PBS洗一遍之后,可再用含0.1% Triton® X-100和5 mg/ml BSA的PBS洗3次,每次5 min。

(2) 脱蜡不彻底,FITC与蜡相结合,导致高背景

(3) 组织样本不干净,含有血液及脂肪等杂质,与FITC结合后形成高背景

Q8:阳性细胞数量少。

A8:通透不充分,可通过调整蛋白酶K或Triton® X-100的孵育时间优化通透步骤。

Q9:组织切片从载玻片上脱落。

A9:组织切片粘附之前的包被不充分。在展片之前,用3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane,TESPA;Sigma Cat.# A3648)包被显微镜载玻片比多聚赖氨酸(poly-L-lysine)效果更好。

Q10:显微镜或流式细胞仪分析只剩下很少的细胞。

A10:在操作过程中丢失大量细胞。①可以提高起始的细胞量;②在制备细胞悬液时,离心过程中用含1% BSA的PBS洗细胞。

Q11:标记率低。

A11:如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失),应用溶于1 ×PBS(PH7.4)中的4%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。过度的固定导致与蛋白过度交联也会导致标记效率低,可以适当缩短固定时间;或用溶于1 ×PBS(PH7.4)的2%多聚甲醛固定。

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