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NR604-VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina
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NR604-VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina

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NR604-01/02
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¥
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VAHTS® Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina

快速转录组文库构建试剂盒

快速:极简的操作流程,使建库时间缩短了 2 h

兼容:兼容多种 RNA 富集模块,随心搭配

通用:灵活自由的选择链特异或非链特异文库

1.数据质量佳

以1 μg 以及50 ng 的293T 细胞总RNA起始,分别使用Vazyme 的NR604 以及K*、N*、A* 公司的试剂盒构建链特异性RNA文库,质控合格后的文库使用Illumina Hiseq X 10 平台进行PE150 测序。

结果显示: Vazyme 的数据质量在同类产品中处于优势地位。

2.Mapping率高

 

与其他同类产品相比,Vazyme 在Mapping率上表现更加优秀。

3.基因检出数多

与其他同类产品相比,Vazyme 在基因检出数上表现更加丰富。

4.文库均一性好

本产品构建的文库数据分布均匀,没有5’或3’偏好性,并且与市面上同类产品高度一致。

VAHTS® Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina是针对Illumina高通量测序平台定向开发的转录组文库构建专用试剂盒。试剂盒包含两种类型的cDNA二链合成Buffer,可根据需要选择进行普通转录组或链特异转录组建库。

试剂盒将二链合成、末端修复和dA-Tailing合并为一步,中间不需要纯化步骤,极大的简化了操作流程,缩短了建库时间。优化的反应体系,提高了文库转化效率,能兼容更低起始投入量,对不同起始量的RNA都有均一的覆盖度。

本试剂盒利用磁珠分选的方式,可以快速获得特定长度的文库,能够满足不同实验的个性化需求。试剂盒包含的所有酶和缓冲液都经过了严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

-30°C~-15°C保存

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1.如果文库浓度过低,可以从哪些角度去寻找原因并如何改进?

以高质量的RNA样品为模板构建得到的文库浓度都能达到上机测序要求,如果无法提供合格的RNA样品,可尝试使用以下方法弥补:

①起始量:提高样品起始量;

②做几个重复的样品,到片段化步骤合并在一起,或做到PCR前合并在一起;

③做不分选方案:94℃ 8 min打断条件下RNA片段虽然偏小,但是分布会很集中,均一性也较好,有些个性化样品会出现打断不均一、某些大小的片段较多等问题,经过PCR后更明显,出现刺峰,这种情况在不分选方案中出现很少。

2.rRNA残留较高的问题

注意mRNA获取方法的不同,其兼容的起始量有所不同,请选择规格范围内的起始总RNA投入。

①Poly(A)法富集法,例如VAHTS® mRNA Capture Beads (Vazyme #N401)兼容起始量为0.05 -4 μg;

②使用Ribo-off® rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Vazyme #N406)去除rRNA兼容的起始量为0.05 - 1 μg;

③使用Ribo-off® rRNA Depletion Kit (Bactria) (Vazyme #N407)去除rRNA兼容的起始量为1 - 5 μg;

④使用Ribo-off® rRNA Depletion Kit (Plant) (Vazyme #N409)去除rRNA兼容的起始量为1 - 5 μg。

3.文库定量常见问题

文库定量有两种方式:Qubit和qPCR分别测定文库质量浓度和文库摩尔浓度。其中由于qPCR利用成簇反应引物进行扩增定量,较为真实的反映出文库中可用于上机测序的DNA片段的数量,所以qPCR得到的文库定量结果较为可信,但在qPCR过程单链能够被有效测定,而在Qubit测定时,单链部分不计入有效浓度,因此表现为Qubit测定浓度低于qPCR定量浓度约10% - 50%。一般可同时使用两种方式定量文库,相互校正。

4.关于选择接头的说明

目前,该试剂盒适用接头分为三套组合:

组合一:VAHTS® RNA Adapters set 1/2 for Illumina (Adapter 1 - 27, Vazyme #N803 、Vazyme#N804)共包括24个不同接头,分为两个单独包装,依序号各含有12个不同接头;

组合二:VAHTS® RNA Adapters set 3 - set 6 for Illumina (Adapter 1 - 96, Vazyme #N809、Vazyme #N810、Vazyme #N811、Vazyme #N812)共包括96个不同接头,分为四个单独包装,依序号各含有24个不同接头;

以上两套接头可在同批测序样品中混合使用,可参考以下建议:

◇同批测序样品数< 24时,建议选择组合一;当样品数< 12时,可选择该组合的单独包装;

◇24 <同批测序样品数< 96时,建议选择组合二;也可根据具体样品数选择该组合的单独包装。

组合三:VAHTS® RNA Multiplex Oligos set 1/2 for Illumina (Vazyme #N323、Vazyme #N324)分别包含含VAHTS RNA Adapter-S for Illumina、8种VAHTS i5 PCR Primers以及12种VAHTS i7 PCR Primers,共同配合使用可用于构建多至384种不同组合的双端Index标记文库。

5.本试剂盒是否适合用于Small RNA文库制备?

不适用。因为Small RNA的长度仅为22 nt左右,而本试剂盒中磁珠抓取片段最低为100 bp以上,无法有效富集到Small RNA片段。

6.FFPE样本是否可以用该试剂盒建库?

FFPE样本中的mRNA会有一定降解,完整度较差,建议与Ribo-off® rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat) (Vazyme #N406)试剂盒搭配使用,进行文库构建。

7.使用说明书方案进行分选,分选插入片段偏大,为什么?

使用磁珠分选过程中,磁珠未平衡至室温、未混匀、移液器不准、枪头挂壁严重等均会致使磁珠加入量少于规定值,导致所分选的插入片段偏大。

8.文库扩增最高可以使用多少循环?

可根据起始量来调整循环数;如果不确定,建议取1 μl进行Qubit检测后酌情再补1 - 2个循环,最多不超过17个循环。

9.文库进行Agilent 2100 Bioanalyzer质检,发现产生双峰,产生的原因?

①RNA有杂质残留,建库过程中发生降解,到PCR步骤前的有效模板量低,PCR时由于模板不足发生了非特异性扩增。建议将RNA样品在65℃条件下加热15 min,检测是否降解,如果确实为RNA的问题则需要重新提取RNA。

②物种本身比较特殊,RNA打断后片段不是连续且均一的分布,做分选方案时可能分选到了两个范围的片段。

③文库浓度较高时使用高敏芯片检测。建议使用Agilent DNA 1000 kit检测,或将文库稀释到适当的浓度后用Agilent DNA HS kit检测。

10.关于在进行Agilent 2100 Bioanalyzer、Qubit及qPCR检测时,高产量文库出现过度扩增的解释。

高产量文库通常会出现不同程度的过度扩增现象。因为在文库扩增后期,通常引物被最先耗尽,大量文库片段在无法结合到引物的情况下,片段之间通过不完全匹配关系退火结合,从而形成部分双链+部分单链的杂合链,且片段更大。根据不同检测方式的对应原理,过度扩增产物在Agilent 2100 Bioanalyzer峰型中表现为upper marker之后有轻微翘尾;但以上现象均属正常,不影响文库测序和数据分析。

 

暂未实现,敬请期待
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