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Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina(pG-Tn5)
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Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina(pG-Tn5)

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TD901-01/02
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HyperactiveTM In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina(pG-Tn5)

操作简单:可一步实现DNA的片段化和接头连接,仅需9 h即可实现从细胞到二代测序文库的转化

超高活性:兼具Protein G&Tn5活性,DNA片段化活性极高

细胞起始量低:可兼容低至60个细胞,甚至单细胞

纯度高:蛋白纯度高、核酸残留低

1. CUT&Tag技术原理及应用

CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)是替换传统的ChIP-Seq用以研究蛋白质-基因组互作的新技术,与后者相比,它具有显著优势,如:信噪比高,可重复性好,实验周期短(1天实现从细胞到文库构建),细胞投入量低等,尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。

CUT&Tag技术的实验流程简单,主要包括:①收集细胞;②分别孵育一抗和二抗;③孵育pA/pG-Tn5转座子(Hyperactive pA/pG-Tn5 Transposon);④激活转座子,进行DNA片段化;⑤DNA提取;⑥文库扩增与纯化。

2. 转座子切割活性高

如图所示,对Vazyme #TD901中提供的pG-Tn5转座子进行活性检测,投入50 ng 人基因组DNA(gDNA),1 μl转座子可快速(10 min)实现DNA片段化,说明该融合酶切割DNA活性很高。

3. 细胞起始量低

A: CUT&Tag峰形图

100 cells    

10,000 cells

如图A所示:投入不同起始量的HEK293细胞(100或10,000个细胞),按照Vazyme #TD901说明书推荐的反应体系进行CUT&Tag实验;其中,pG-Tn5转座子使用的终浓度为0.04 μM,一抗为H3K27me3(CST,#9733),二抗为Goat anti Rabbit(Bioworld,#BS13271)。通过使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行文库分布检测,结果显示对于不同细胞投入量(100个或10,000个细胞),均可构建出与文献中类似的呈现Ladder状的文库,说明该体系能够兼容低细胞起始量的实验。

B:Peak 富集

如图B所示:将图A中的CUT&Tag文库进行二代测序分析,可以看出,100个细胞可以达到与10,000细胞类似的Peak富集,且信噪比显著高于ChIP-Seq。

4. 实验重复性好

如上图所示,投入不同起始量(1,000、10,000或100,000)的HEK293细胞,每种起始量做2个重复,按照Vazyme #TD901说明书推荐的反应体系进行CUT&Tag实验;其中,pG-Tn5转座子使用的终浓度为0.04 μM,一抗为H3K27me3(CST,#9733),二抗为Goat anti Rabbit(Bioworld,#BS13271),阴性对照为与一抗同源的IgG(CST,#2729)。对上述文库样本进行二代测序,针对富集的reads进行pearson相关性分析,可以看出,平行样本之间的重复性较好。

HyperactiveTM In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina是针对CUT&Tag技术定向开发的专用试剂盒。CUT&Tag技术是一种研究蛋白质-DNA互作的新方法,通过将Protein G或Protein A与经过工程学改造的超高活性Tn5转座酶融合,形成兼具双重活性的新型融合酶(Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 Transposase),在抗体引导下精准靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。与传统的ChIP-Seq相比,该技术具有细胞投入量低、实验周期短、信噪比高、可重复性好等优势,尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。试剂盒中所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

BOX 1:ConA beads 2 ~ 8℃保存,其余组分室温储存。

BOX 2:5% Digitonin -30 ~ -15℃保存,室温下可保存1周;

10 × Binding Buffer -30 ~ -15℃保存,2 ~ 8℃下可保存6个月;

其余组分-30 ~ -15℃储存。

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Q1:CUT&Tag适用于什么物种?

A1:CUT&Tag Protocol广泛适用于常规哺乳动物细胞的蛋白-DNA互作研究,酵母、植物等细胞可以经过特殊的处理(破除细胞壁或者提取细胞核)来进行实验,操作可以参照CUT&RUN技术的前端处理方式。

Q2:ConA磁珠主要作用是什么?

A2:ConA磁珠是采用刀豆蛋白A包被过的,能与细胞膜上的糖蛋白结合,从而吸附细胞,使细胞处理操作可视化,从而减少在后续实验过程中的细胞的损失。

Q3:TD901与TD902如何选择?

A3:TD901试剂盒提供的是Protein G与Tn5融合的转座子,TD902提供的是Protein A与Tn5融合的转座子,可以直接用于CUT&Tag实验;针对大多数抗体,二者均具有广泛的适用性,但是Protein A对兔来源抗体的亲和力相对较高,Protein G对于小鼠等部分哺乳动物抗体的亲和力较高,请根据抗体来源种属与Protein A或者Protein G的亲和能力进行选择。

Q4:CUT&Tag是不是只能用Illumina平台测序?

A4:TD901和TD902提供的转座子是针对Illumina平台定向设计的,如果需要使用其他测序平台,可以使用Vazyme #S602和#S603,更换适配相应平台的接头和Index扩增引物即可。

 

暂未实现,敬请期待
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