RNA isolater Total RNA Extraction Reagent

Q1：RNA降解。

A1：(1) 组织样本保存不当。RNA提取时要选新鲜组织或细胞样本，若为冻存样本，尽量避免反复冻融。样品离开活体或原来的生长环境后，样品中的内源RNase开始降解RNA，降解速度与内源RNase的含量及温度有关。

(2) 投入样本较多，导致裂解不充分。试剂不能有效抑制样品中所有的RNase。

(3) RNA保存时间过久，发生降解。对提取的RNA进行纯度和完整度检测，分管在-80℃长期保存或在-20℃短期保存，尽快使用，避免反复冻融。

Q2：组织样本应该如何保存。

A2：方法一：组织离体后迅速投入液氮冷冻，并用液氮保存。或待冻结后，将样本转移至 -80℃保存。注意：不能直接将新鲜组织直接放入 -80℃冷冻，否则样品的冻结会是一个缓慢的过程，在这个过程中内源 RNase 足以将 RNA 降解。

方法二：将新鲜组织充分浸泡于RNA Keeper^® Tissue Stabilizer(R501)中，可在室温存放一周，4℃存放一个月，-20℃/-80℃长期保存。

Q3：提取的RNA有基因组DNA污染。

A3：(1) 向裂解液中加入氯仿后，需要在低温下（2-8℃）高速离心。离心后，RNA被抽提到上层的水相中，中、下层是有机相，含有氯仿，DNA即存在于中层。氯仿在常温下会与水以一定比例互溶，因此，常温离心会导致上层水相中也有少量基因组DNA的污染。吸取上层液体时，应非常小心，避免吸到中间层和下层。

(2) RNA样品中的少量基因组DNA残留，也可以通过后续逆转录反应前的基因组去除步骤进行去除，gDNA wiper能够高效去除100 ng基因组DNA。

Q4：加入异丙醇离心后无沉淀。

A4：RNA含量可能较低。建议加入异丙醇后在4℃或-20℃放置10-30 min后再离心。若依然看不见沉淀，在后面弃上清的操作时，采用吸取而不是倾倒的方法，以免沉淀丢失。

Q5：能否用于原核生物RNA的提取。

A5：可以，需配合R402（Bacteria RNA Plus Reagent）同时使用，可大幅提高原核生物RNA提取产量，同时保证良好的产物质量。

Q6：细胞样本比较少，该如何操作。

A6：裂解的过程中需要反复吹打细胞确保与裂解液充分混匀，冰上静置10 min。加入氯仿后需要剧烈振荡15s（难裂解的样品涡旋15s），然后在冰上静置5-10 min后离心，后续就常规沉淀提取。

Q7：液氮研磨组织时，若组织变为冻霜状，比较粘连，该如何操作。

A7：将组织液氮研磨成粉末后，转移至提前在液氮中预冷的EP管中，加入RNA isolater后用枪上下吹直至将絮状物吹散后，进行后续实验。同时可以减小研磨组织的体积，大小等同于指甲盖一半的体积，减少絮状物的产生。