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ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)
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ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)

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Q341-02/03
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ChamQTMSYBR®qPCR Master Mix(High ROX Premixed)

高灵敏性染料法定量PCR 检测试剂盒

高效热启动酶:新型抗体法热启动酶Champagne TaqTM DNA Polymerase,扩增能力强、灵敏度高

扩增高度特异:专利特异性促进因子ExactorTM,最大程度抑制非特异扩增和引物二聚体

扩增性能优异:提供5-35的宽广线性范围和个位数拷贝的检测灵敏度扩增稳定、定量结果具有高度重复性

 

图1. 广阔的定量域 

以HeLa 细胞cDNA 为稀释液,将pUC19 质粒进行8 个10 倍梯度稀释,第8 个稀释梯度中质粒拷贝数浓度约为5 copies/4 μl。使用ChamQTM 预混液对各稀释梯度中的pUC19 质粒进行检测,每孔模板使用量为4 μl。可以看到,ChamQ TM 预混液在宽广的模板量区间内具有优秀的线性关系,可轻松检测出个位数拷贝的待测模板。

 

图2. 精准的分辨力

以HeLa 细胞cDNA 原液以及10 个两倍稀释梯度共计11 个样品为模板,使用ChamQTM 预混液检测P450C17 基因的表达,每个模板设置6 个复孔。可以看到,ChamQTM 预混液可以在宽广的范围内精确分辨2 倍的模板浓度差异,且扩增高度特异。统计结果显示,各稀释度之间的平均△CT 为1.09,SD 值仅为0.08。

 

图3. 卓越的特异性 

以HeLa 细胞cDNA 为模板,使用ChamQTM 预混液随机测试48个基因,用以检测扩增特异性。通过对融解曲线分析可知,48 个体系中ChamQTM 预混液可完成46 个(95%) 目标基因检测,说明ChamQTM 预混液拥有卓越的特异性。

ChamQTM SYBR® qPCR Master Mix 采用的Champagne TaqTM  DNA Polymerase 是一种新型的抗体法热启动聚合酶,具有兼容性广、扩增性能强、灵敏度高等诸多优点,配以Vazyme 独有的专利特异性促进因子ExactorTM,完美的平衡了扩增特异性和扩增效率之间的矛盾。在不失扩增特异性的同时,ChamQTM 检测体系可以轻松检测到个位数拷贝的基因表达,对目标基因定量准确可信。

组分

Q341-02 (500 rxn/20 μl reaction)

Q341-03 (2,500 rxn/20 μl reaction)

2 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed) a

1.25 ml × 4

Q341-02 × 5

a. 包含dNTP,Mg 2+ ,Champagne Taq DNA Polymerase,SYBR Green I ,ROX Reference Dye 1等。

- 30~- 15℃避光保存;Master Mix解冻后可于2~8℃避光条件下稳定存放6个月。

 
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1.绝对定量标准曲线线性关系不佳

a) 加样误差:加大模板稀释倍数,提高加样体积。

b) 标准品降解:重新制备标准品,重复实验。

c) 模板浓度太高:增加模板稀释倍数。

2.在定量时,如何判断cDNA 投入量

首次得到的cDNA 需要进行多个梯度稀释,将不同梯度稀释的cDNA 进行qPCR 定量,选取CT 值落在18-28,或者15-33 范围内的扩增曲线对应的cDNA 的稀释梯度作为后续该基因的参考稀释度。(CT 值在18-28,或者15-33 区间范围被认为是准确的)   

3.如何确定基因表达量高低

如果基因扩增CT 值超过30,使用PCR 产物通过梯度稀释创建标准曲线,判断该引物扩增效率,若扩增效率满足90-120%,则可以判断该基因扩增CT 值偏大是由于基因表达量低所致。

4.阴性对照出现明显扩增

a) 反应体系污染:更换新的Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。

b) 引物二聚体的出现:配合融解曲线进行分析。

5.融解曲线出现多峰

a) 引物设计不优:根据设计原则设计合成新的引物。

b) 引物浓度太高:适当降低引物浓度。

c) cDNA 模板带有基因组污染:重新制备cDNA 模板。

6.CT 值出现太晚

a) 扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计合成引物。

b) 模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

c) 模板降解:重新制备模板,重复实验。

d) PCR 产物太长:推荐PCR 产物长度为80 bp-150 bp。

e) 体系中存在PCR 抑制剂:一般为模板带入,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。

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