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  • C214-说明书.pdf

    大小:
    2020-12-03 16:36:00
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Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2

MutExpress IIFastMutagenesis KitV2 一步法单/双点突变试剂盒  Phanta®MaxSuper-FidelityDNAPolymerase高保真酶提供保真度超高的PCR反应扩增以指数方式进行,模板使用量极低,有利于原始甲基化模板的彻底降解扩增产物经DpnI消化后可直接用于重组反应可对目标质粒上单个位点或两个不连续位点(相距超过50bp)同时进行定点突变实验流程
价格:
¥
560.0
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货号:
C214-01/02
数量:
-
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产品详情
FAQ
组分
说明书

Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2

一步法单 / 双点突变试剂盒

Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶提供保真度超高的PCR 反应
       扩增以指数方式进行,模板使用量极低,有利于原始甲基化模板的彻底降解
       扩增产物经DpnI 消化后可直接用于重组反应
       可对目标质粒上单个位点或两个不连续位点( 相距超过50 bp) 同时进行定点突变

提供在线引物设计软件CE Design

实验流程:

 

Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 是基于ClonExpress® 快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒,目标质粒扩增产物经DpnI 消化、ClonExpress® 重组环化后直接进行转化即可完成定点突变。该试剂盒由Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 扩增模块和ClonExpress® 快速克隆模块组成。Phanta® MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性,ClonExpress® 快速克隆系统利用高效同源重组反应替代了传统的退火成环反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及极高的成功率,使得Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 成为DNA 定点突变首选试剂盒

组分

C214-01(10 rxn)

C214-02(25 rxn)

2×Max Buffer

1.25 mL

1.25 mL

dNTP Mix(10 mM each)

20μl

50μl

Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase

20μl

50μl

DpnI(10 U/μl)

20μl

50μl

5×CE II Buffer

40μl

100μl

Exnase®II

20μl

50μl

- 20℃储存

关键词:
C214-01/02
一步法单/双点突变试剂盒
未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:质粒模板无法正常扩增。

A1:(1) 引物设计有误:核对引物设计方案;

(2) 扩增体系配制错误:重复实验;

(3) 扩增反应条件不优化:调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序;

(4) 模板质粒质量偏差:长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的质粒作为模板。

Q2:平板上长不出克隆或者克隆数很少。

A2:(1) 感受态效率低:使用新制备或妥善冻存的感受态细胞,确保转化效率需107 cfu/μg。每次可设置一组转化质粒的对照试验,以检测感受态细胞的转化效率;

(2) 重组反应体系中DNA量不足或比例不佳(双碱基突变):尽量按照说明书推荐的量配置重组体系。请务必预先检测DpnI消化产物的浓度。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响,测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大;

(3) 重组环化反应体系中DNA不纯,抑制反应:未纯化DpnI消化产物加入重组体系内的总体积不应超过4ul(反应体系体积1/5)。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂(如EDTA)的带入。因此,我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用8.0的ddH2O替代),请勿使用TE进行DNA保存;

(4) 感受态细胞中加入了过多的反应产物:反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率; 

(5) 出现转化抑制效应:当转化的DNA浓度太高时,会抑制转化反应,将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。

Q3:定点突变未正确完成。

A3:(1) 引物设计错误:核对引物设计方案;

(2) 扩增反应所用模板为非甲基化的质粒:DpnI只能识别甲基化DNA,请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板;

(3) 扩增反应使用过多的模板质粒:对大多数质粒,1ng模板量已足以使扩增反应正常进行,过多的质粒模板将会导致DpnI消化不完全,降低突变成功率。

Q4:非目标位点突变。

A4:(1) 模板质粒携带未知位点突变:测序确认模板质粒序列正确性;

(2) 扩增循环数过多:为了防止扩增过程中引入非目标突变,扩增循环数不宜超过35。如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数应不超过30。

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