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Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2
浏览量:

Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2

货  号:
C214-01/02
价  格:
¥
560.00
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Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2

一步法单 / 双点突变试剂盒

Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶提供保真度超高的PCR 反应
       扩增以指数方式进行,模板使用量极低,有利于原始甲基化模板的彻底降解
       扩增产物经DpnI 消化后可直接用于重组反应
       可对目标质粒上单个位点或两个不连续位点( 相距超过50 bp) 同时进行定点突变

实验流程:

 

Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 是基于ClonExpress® 快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒,目标质粒扩增产物经DpnI 消化、ClonExpress® 重组环化后直接进行转化即可完成定点突变。该试剂盒由Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 扩增模块和ClonExpress® 快速克隆模块组成。Phanta® MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性,ClonExpress® 快速克隆系统利用高效同源重组反应替代了传统的退火成环反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及极高的成功率,使得Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 成为DNA 定点突变首选试剂盒

组分

C214-01(10 rxn)

C214-02(25 rxn)

2×Max Buffer

1.25 mL

1.25 mL

dNTP Mix(10 mM each)

20μl

50μl

Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase

20μl

50μl

DpnI(10 U/μl)

20μl

50μl

5×CE II Buffer

40μl

100μl

Exnase®II

20μl

50μl

- 20℃储存

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:质粒模板无法正常扩增。

A1:(1) 引物设计有误:核对引物设计方案;

(2) 扩增体系配制错误:重复实验;

(3) 扩增反应条件不优化:调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序;

(4) 模板质粒质量偏差:长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的质粒作为模板。

Q2:平板上长不出克隆或者克隆数很少。

A2:(1) 感受态效率低:使用新制备或妥善冻存的感受态细胞,确保转化效率需107 cfu/μg。每次可设置一组转化质粒的对照试验,以检测感受态细胞的转化效率;

(2) 重组反应体系中DNA量不足或比例不佳(双碱基突变):尽量按照说明书推荐的量配置重组体系。请务必预先检测DpnI消化产物的浓度。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响,测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大;

(3) 重组环化反应体系中DNA不纯,抑制反应:未纯化DpnI消化产物加入重组体系内的总体积不应超过4ul(反应体系体积1/5)。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂(如EDTA)的带入。因此,我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用8.0的ddH2O替代),请勿使用TE进行DNA保存;

(4) 感受态细胞中加入了过多的反应产物:反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率; 

(5) 出现转化抑制效应:当转化的DNA浓度太高时,会抑制转化反应,将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。

Q3:定点突变未正确完成。

A3:(1) 引物设计错误:核对引物设计方案;

(2) 扩增反应所用模板为非甲基化的质粒:DpnI只能识别甲基化DNA,请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板;

(3) 扩增反应使用过多的模板质粒:对大多数质粒,1ng模板量已足以使扩增反应正常进行,过多的质粒模板将会导致DpnI消化不完全,降低突变成功率。

Q4:非目标位点突变。

A4:(1) 模板质粒携带未知位点突变:测序确认模板质粒序列正确性;

(2) 扩增循环数过多:为了防止扩增过程中引入非目标突变,扩增循环数不宜超过35。如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数应不超过30。

Xu D, Zhang T, Xiao J, et al. (2015). Modification of BECN1 by ISG15 plays a crucial role in autophagy regulation by type I IFN/interferon. Autophagy, 11(4):617-628. IF:11.753
暂未实现,敬请期待
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货  号
MD101-01/02
货  号
MD102-01/02
货  号
MD103-01/02
货  号
MD104-01/02