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Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2
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Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2

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C215-01/02
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¥
1280.00
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Mut Express® MultiS Fast Mutagenesis Kit V2

一步法多点突变试剂盒

Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase提供突变率最低的高保真PCR

Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase卓越的长片段扩增能力,广泛适用于20 kb以内任何质粒的扩增

扩增以指数方式进行,模板使用量极低,有利于原始甲基化模板的彻底降解

ClonExpress®快速克隆系统高效环化PCR产物

DpnI消除原始模板污染

可一步实现目标质粒上三至五个不连续位点(相距超过50 bp)的定点突变

使用Mut Express® MultiS 进行不连续三点突变实验流程:

以待突变位点A、B、C 为界,将质粒分为AB、BC 和CA 三段。在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物。以原始质粒为模板,分别扩增AB 段(A Forward Primer 和B Reverse Primer)BC 段(B Forward Primer 和C Reverse Primer) 和CA 段(C Forward Primer和A Reverse Primer) (I)。扩增产物经DpnI消化(I) 后,进行重组环化(II)。重组产物直接进行转化即可完成定点突变(III)。

 

Mut Express® MultiS Fast Mutagenesis Kit V2 是基于ClonExpress® 快速克隆技术的多位点定点突变系统。使用本试剂盒,可一次性向目标质粒上三至五个不连续位点同时引入定点突变。该试剂盒由Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 扩增模块和ClonExpress®快速克隆模块组成。Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性。ClonExpress® 快速克隆系统利用高效同源重组技术替代了传统的退火成环反应,大大提高了环化效率。使用Mut Express® MultiS 定点突变试剂盒进行DNA 定点突变时,引物设计灵活、模板需求量低,且如扩增产物特异,DpnI 消化后可不进行DNA 纯化而直接用于重组反应。专门针对多位点定点突变而优化的重组酶、高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及惊人的定点突变效率,使得Mut Express® MultiS Fast Mutagenesis Kit V2 成为DNA 多点突变首选试剂盒。

组分

C215-01 (10 rxn)

C215-02 (25 rxn)

2 × Max Buffer

1.25 ml

3 × 1.25 ml

dNTP Mix (10 mM each)

50 μl

125 μl

Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase

50 μl

125 μl

DpnI (10 U/μl)

50 μl

125 μl

5 × CE MultiS Buffer

40 μl

100 μl

Exnase® MultiS

20 μl

50 μl

- 20℃储存

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:质粒模板无法正常扩增。

A1:(1) 引物设计有误:核对引物设计方案;

(2) 扩增体系配制错误:重复实验;

(3) 扩增反应条件不优化:调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序;

(4) 模板质粒质量偏差:长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的质粒作为模板。

Q2:平板上长不出克隆或者克隆数很少。

A2:(1) 感受态效率低:使用新制备或妥善冻存的感受态细胞,确保转化效率需107 cfu/μg。每次可设置一组转化质粒的对照试验,以检测感受态细胞的转化效率;

(2) 重组反应体系中DNA量不足或比例不佳(双碱基突变):尽量按照说明书推荐的量配置重组体系。请务必预先检测DpnI消化产物的浓度。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响,测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大;

(3) 重组环化反应体系中DNA不纯,抑制反应:未纯化DpnI消化产物加入重组体系内的总体积不应超过4ul(反应体系体积1/5)。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂(如EDTA)的带入。因此,我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用8.0的ddH2O替代),请勿使用TE进行DNA保存;

(4) 感受态细胞中加入了过多的反应产物:反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率; 

(5) 出现转化抑制效应:当转化的DNA浓度太高时,会抑制转化反应,将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。

Q3:定点突变未正确完成。

A3:(1) 引物设计错误:核对引物设计方案;

(2) 扩增反应所用模板为非甲基化的质粒:DpnI只能识别甲基化DNA,请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板;

(3) 扩增反应使用过多的模板质粒:对大多数质粒,1ng模板量已足以使扩增反应正常进行,过多的质粒模板将会导致DpnI消化不完全,降低突变成功率。

Q4:非目标位点突变。

A4:(1) 模板质粒携带未知位点突变:测序确认模板质粒序列正确性;

(2) 扩增循环数过多:为了防止扩增过程中引入非目标突变,扩增循环数不宜超过35。如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数应不超过30。

Xu D, Zhang T, Xiao J, et al. (2015). Modification of BECN1 by ISG15 plays a crucial role in autophagy regulation by type I IFN/interferon. Autophagy, 11(4):617-628. IF:11.753
暂未实现,敬请期待
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MD101-01/02
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MD102-01/02
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MD103-01/02
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MD104-01/02