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ClonExpress II One Step Cloning Kit
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ClonExpress II One Step Cloning Kit

货  号:
C112-01/02
价  格:
¥
600.00
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ClonExpress®II One Step Cloning Kit 

非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒

  • 简单、快速、高效,适用于任何载体

  • 无需考虑插入片段携带的酶切位点

  • 可高效克隆 50 bp-10 kb 的 DNA 片段

  • 线性化克隆载体和 PCR 产物可不纯化直接克隆

  • 无连接酶,无自连,阳性率 >95%

  • 提供引物设计软件CE Design

1.克隆效率极高

1

重组产物转化后平板上一般可形成数千个单克隆,而无插入片段的阴性对照反应转化后只有数个单克隆形成。因此ClonExpress®系统的自连背景会大大降低连接酶依赖的克隆方式。

2.克隆阳性率95%以上

图2 

鉴定酶切结果表明,克隆阳性率可达95%以上。

ClonExpress®技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术,可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。 ClonExpress®II 是新一代重组克隆试剂盒,包含增强的重组酶 Exnase®II。使用任意方式将载体进行线性化;在插入片段正 / 反向 PCR 引物 5’ 端引入线性化载体的末端序列,使得 PCR 产物 5’ 和 3’ 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列 (15 bp-20 bp)。这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化载体按一定比例混合后,在Exnase®II 重组酶的催化下,仅需反应 30 min 即可进行转化,完成定向克隆,阳性率可达 95% 以上。

 

组分

C112-01 (25 rxn)

C112-02 (50 rxn)

5 × CE II Buffer

100 μl

200 μl

Exnase®II

50 μl

100 μl

500 bp control insert (20 ng/μl)

5 μl

5 μl

pUC19 control vector,linearized (50 ng/μl,Amp+)

5 μl

5 μl

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Q1:引物如何设计?

A1:(1) 引物设计:官网引物设计软件CE Design V1.04,选择相应模块进行设计;

(2) 载体的线性化方式有三种:双酶切、单酶切和反向PCR,优先选择双酶切;

(3) 引物由三部分组成:同源臂(15-20 bp,不计算酶切位点和残留碱基,GC含量40%-60%)+酶切位点(根据实验需求保留或舍弃)+特异性引物(引物Tm值的计算不包括同源臂的序列)。

Q2:平板上长不出克隆或者克隆数很少。

A2:(1) 引物设计不正确:引物包含15-20 bp同源臂(不计算酶切位点),GC含量40%-60%;若同源臂的GC含量过高或过低,可重新选择插入位点;

(2) 线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量,即比例不佳:尽量按照说明书推荐的量和比例配置重组体系;

(3) 重组体系不低于10 μl,各组分添加不低于1μl(避免低体积添加造成量取不准);若载体或片段浓度过低导致添加量超过20 μl,可同比例降低载体和片段的添加量;插入片段长于载体时,重组体系中片段与载体的摩尔比为2:1;

(4) 载体和插入片段不纯,抑制反应:未纯化DNA不应超过4 μl(反应体系体积的1/5);建议线性化载体和PCR产物进行胶回收纯化,纯化产物溶解在pH 8.0的ddH2O保存;

(5) 感受态细胞的转化效率需大于107 cfu/μg,重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率;选择克隆用感受态细胞(如DH5α/XL10),不能选择表达用感受态细胞;

(6) 酶切获得的载体应经加热处理失活限制性内切酶,对于加热处理不能失活的酶切体系,必须经过胶回收纯化;

(7) 核查基因是否致死。

Q3:多数克隆含有不正确的插入片段。

A3:PCR产物混有非特异性产物:优化PCR体系,提高特异性;胶回收PCR产物;鉴定更多的克隆。

Q4:插入片段出现碱基突变。

A4:插入片段在PCR获得时使用高保真的聚合酶;若突变发生在同源臂区域,请进行引物序列核对。

Q5:多数克隆不含插入片段。

A5:(1) 克隆载体线性化不完全:可通过阴性对照检测载体是否线性化完全;对于优化酶切体系,提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物;

(2) 插入片段获得的PCR体系中混入了相同抗性的质粒:PCR扩增模板为环状质粒时,如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnI消化,或者进行胶回收纯化。

Q6:阳性对照不长斑或很少。

A6:(1) 平板抗性使用错误:试剂盒中提供的对照载体的抗性为A+抗性;

(2) 感受态细胞效率低:确保转化效率>107cfu/μg,可进行简单检测,将1 ng质粒转化至100 μl感受态细胞中,取1/10进行涂板,生长1000个菌斑,估算感受态转化效率为107cfu/μg;重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率;感受态选择克隆感受态(如DH5α/XL10),不能用表达感受态。

Q7:菌液PCR无条带。

A7:(1) 引物不正确:建议使用载体的通用引物进行菌检,或至少使用一条通用引物;

(2) PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带,建议优化PCR体系、程序;或者提取质粒,以质粒做模板PCR验证,或着进行酶切验证;

(3) 重组失败:只有空质粒的条带,说明重组不成功,载体线性化不完全,建议优化酶切体系。

Q8:菌种(表达用)保存一段时间后出现表达量下降。

A8:菌种在保存过程中,可能会出现质粒丢失,拷贝数降低的情况,重新培养时适当增加抗生素的浓度,筛选出含高拷贝数质粒的细菌。

暂未实现,敬请期待
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货  号
P515-01/02/03
货  号
MD101-01/02
货  号
MD102-01/02
货  号
MD103-01/02