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ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit
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ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit

货  号:
C115-01/02
价  格:
¥
800.00
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ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit

灵活多变的一体化超快速克隆试剂盒

快速:5 - 15min快速重组;

简单:一管式Mix,操作简便;

高效:高效克隆50 bp~10 kb片段,阳性率>95%;

兼容:单片段、多片段、入门克隆三合一;

零背景:提供零背景、氨苄/卡那双抗性载体

引物设计提供引物设计软件CE Design

1.高度简化的实验流程

通过PCR扩增,使插入片段5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15 - 20 bp)。用2×ClonExpress®Mix,50℃反应5-15 min,进行重组。重组产物直接转化感受态细胞,平板上会形成数百个单克隆供阳性筛选。

2.优异的克隆效率

试剂盒能够高效克隆50 bp-10 kb片段,不同长度单片段50 bp、2 kb、4.5 kb、7.5 kb、10 kb;多片段:四个片段(3 kb)、三个片段(10 kb)、五个片段(3 kb)、五个片段(6 kb),纯化后分别与pCE-Zero vector进行同源重组,重组产物转化化学感受态细胞DH5α(Vazyme #C502),菌落数如下图所示。

试剂盒独特的非连接酶依赖体系,无载体自连,克隆阳性率高达95%以上。重组产物转化平板后,各挑取50个单克隆进行菌落PCR鉴定,不同长度插入片段阳性率如下图所示。

       

 

3.广泛的体系兼容性

试剂盒兼容1至5个片段同源重组,搭配Vazyme高保真酶,PCR产物可不经过纯化直接进行克隆。重组产物转化化学感受态细胞DH5α(Vazyme #C502),XL10(Vazyme #C503),Fast-T1(Vazyme #C505),得到较高克隆效率。

4.载体序列信息及测序方案

pCE-Zero vector载体,测序时使用通用测序引物(M13)即可。

ClonExpress® Ultra One Step Cloning Kit是新一代的重组克隆试剂盒,可快速高效的将1-5个片段定向克隆至任意载体的任意位点,高度优化的2×ClonExpress Mix,50℃反应5-15 min完成重组,操作简单快捷。

组分

C115-01(25 rxn)

C115-02(50 rxn)

2 ×ClonExpress®Mix

125 μl

2 ×125 μl

pCE-Zero vector,linearized (50 ng/μl) *

25 μl

50 μl

500bp Control insert (20 ng/μl)

5 μl

5 μl

*双抗性载体:Amp+,Kan+

- 20℃保存

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:引物如何设计?

A1:(1) 引物设计:官网引物设计软件CE Design V1.04,选择相应模块进行设计;

(2) 载体的线性化方式有三种:双酶切、单酶切和反向PCR,优先选择双酶切;

(3) 引物由三部分组成:同源臂(15-20 bp,不计算酶切位点和残留碱基,GC含量40%-60%)+酶切位点(根据实验需求保留或舍弃)+特异性引物(引物Tm值的计算不包括同源臂的序列)。

Q2:平板上长不出克隆或者克隆数很少。

A2:(1) 引物设计不正确:引物包含15-20 bp同源臂(不计算酶切位点),GC含量40%-60%;若同源臂的GC含量过高或过低,可重新选择插入位点;

(2) 线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量,即比例不佳:尽量按照说明书推荐的量和比例配置重组体系;

(3) 重组体系不低于10 μl,各组分添加不低于1μl(避免低体积添加造成量取不准);若载体或片段浓度过低导致添加量超过20 μl,可同比例降低载体和片段的添加量;插入片段长于载体时,重组体系中片段与载体的摩尔比为2:1;

(4) 载体和插入片段不纯,抑制反应:未纯化DNA不应超过4 μl(反应体系体积的1/5);建议线性化载体和PCR产物进行胶回收纯化,纯化产物溶解在pH 8.0的ddH2O保存;

(5) 感受态细胞的转化效率需大于107 cfu/μg,重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率;选择克隆用感受态细胞(如DH5α/XL10),不能选择表达用感受态细胞;

(6) 酶切获得的载体应经加热处理失活限制性内切酶,对于加热处理不能失活的酶切体系,必须经过胶回收纯化;

(7) 核查基因是否致死。

Q3:多数克隆含有不正确的插入片段。

A3:PCR产物混有非特异性产物:优化PCR体系,提高特异性;胶回收PCR产物;鉴定更多的克隆。

Q4:插入片段出现碱基突变。

A4:插入片段在PCR获得时使用高保真的聚合酶;若突变发生在同源臂区域,请进行引物序列核对。

Q5:多数克隆不含插入片段。

A5:(1) 克隆载体线性化不完全:可通过阴性对照检测载体是否线性化完全;对于优化酶切体系,提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物;

(2) 插入片段获得的PCR体系中混入了相同抗性的质粒:PCR扩增模板为环状质粒时,如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnI消化,或者进行胶回收纯化。

Q6:阳性对照不长斑或很少。

A6:(1) 平板抗性使用错误:试剂盒中提供的对照载体的抗性为A+抗性;

(2) 感受态细胞效率低:确保转化效率>107cfu/μg,可进行简单检测,将1 ng质粒转化至100 μl感受态细胞中,取1/10进行涂板,生长1000个菌斑,估算感受态转化效率为107cfu/μg;重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率;感受态选择克隆感受态(如DH5α/XL10),不能用表达感受态。

Q7:菌液PCR无条带。

A7:(1) 引物不正确:建议使用载体的通用引物进行菌检,或至少使用一条通用引物;

(2) PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带,建议优化PCR体系、程序;或者提取质粒,以质粒做模板PCR验证,或着进行酶切验证;

(3) 重组失败:只有空质粒的条带,说明重组不成功,载体线性化不完全,建议优化酶切体系。

Q8:菌种(表达用)保存一段时间后出现表达量下降。

A8:菌种在保存过程中,可能会出现质粒丢失,拷贝数降低的情况,重新培养时适当增加抗生素的浓度,筛选出含高拷贝数质粒的细菌。

 

暂未实现,敬请期待
暂未实现,敬请期待
货  号
P515-01/02/03
货  号
MD101-01/02
货  号
MD102-01/02
货  号
MD103-01/02