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M-MLV (H-) Reverse Transcriptase

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R021-说明书.pdf

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2021-06-10 17:43:58

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M-MLV (H-) Reverse Transcriptase

M-MLV(H-)ReverseTranscriptase 稳定可靠的逆转录酶 •点突变消除RNaseH活性以获得长的cDNA产物•对于100ng以上的RNA模板具有稳定可靠的逆转录表现•合成片段≤5kb •可用于5’-RACE反应以及cDNA文库构建等实验野生型M-MLV(MoloneyMurineLeukemiaVirus)具有以下几种活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性，依赖于DNA的

价格：

400.0

市场价

元

400.0

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货号：

R021-01

所属分类

通用型逆转录酶/试剂盒

数量：

库存:

9999

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产品详情

FAQ

组分

说明书

M-MLV (H-) Reverse Transcriptase

稳定可靠的逆转录酶

点突变消除RNase H活性以获得长的cDNA产物

对于100 ng以上的RNA模板具有稳定可靠的逆转录表现

合成片段≤5 kb

可用于5’-RACE反应以及cDNA文库构建等实验

野生型M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) 具有以下几种活性：依赖于RNA 的DNA 聚合酶活性，依赖于DNA 的DNA 聚合酶活性和RNase H 活性。由于RNase H 活性能够催化降解RNA/DNA 杂合体中的RNA，因此在cDNA 第一条链的合成反应中可能会降解模板RNA。M-MLV (H-) Reverse Transcriptase 是通过定点突变得到的RNase H 活性缺失的M-MLV 突变体。与常见的通过删除(deletion) RNase H 结构域方法得到的突变体相比，本产品保留了完整的蛋白结构，因此具有与野生型相同的聚合酶活性，可用于较长的cDNA 合成以及全长cDNA 文库的构建等。

组分	10000 U
5×RT Buffer	500 μl
M-MLV(H-) Reverse Transcriptase (200U/μl)	50 μl

-30 ~ -15℃保存。

关键词:

R021-01

稳定可靠的逆转录酶

Q1：原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗？

A1：可以。原核生物RNA没有polyA尾，所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。

Q2：逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix，可以去除残留在RNA中的基因组。最多可以去除多少的基因组？但如果不进行基因组去除，会影响接下来的逆转录吗？

A2：我们做过100ng基因组的测试，去除效率是99.95%。如果不进行基因组去除不会影响逆转录实验的进行，但是如果基因组残留严重但不去除的话，会影响接下来定量实验的准确性。

Q3：延长逆转录时间，是否可以提高逆转录效率？

A3：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升；对于一些GC含量较高或含高级结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。

Q4：做了No RT Control发现有gDNA残留怎么办？

A4：如果使用试剂盒中的gDNA wiper模块进行gDNA去除，但No RT Control仍有CT值，可通过实验组和No RT Control组的CT值来判断实验数据是否可用。当实验组CT值与No RT Control对照组CT值差值大于5，说明由gDNA导致的误差小于5%，则可以忽略gDNA污染；若实验组与对照组CT值差值小于3或者几乎一致，则实验组扩增产物的模板很大一部分来源于gDNA，这样的实验组就失去定量意义。

Q5：如何评判RNA质量？

A5：RNA质量从两个方面反应：

(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则 RNA 已完全降解，需要重新提取。

(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD_260/280和OD_260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断，蛋白、离子等残留会使比值降低。

Q6：如何选择逆转录的引物？

A6：根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。

(1) 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

(2) Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

(3) 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。

cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。

Q7：可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？

A7：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。