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HiScript II Reverse Transcriptase

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R201-01/02
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HiScript® II Reverse Transcriptase

具有超强耐热性和延伸效率的新一代逆转录酶

50℃半衰期超过240 min,55℃半衰期可达60 min

5 min 即可合成长达10 kb 的cDNA,适合快速逆转录反应

更高的杂质耐受度、更高的检测灵敏度,分子诊断首选逆转录酶

1.极高的热稳定性

2.更强的杂质耐受度

以1 μg HeLa 细胞总RNA 为模板,用不同的酶进行逆转录,同时在体系中加入不同浓度的各种反应抑制物。取1 μl cDNA 为模板,AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix 扩增human B2M基因,比较各种条件下CT 值大小。更小的CT 值代表更高的逆转录效率,即更高的杂质耐受度。

3.更高的检测灵敏度

以1 μg-1 pg HeLa 细胞总RNA 为模板,用HiScript® II Reverse Transcriptase (R201) 做逆转录,取1 μl cDNA为模板,用AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix分别扩增B2M基因(A)和EGFR 基因(B)。

通过专利的体外分子进化技术,在HiScript® Reverse Transcriptase的基础上,获得的一个全新的逆转录酶突变体HiScript® II ReverseTranscriptase,其热稳定性大幅提高。HiScript® II ReverseTranscriptase 在50℃的半衰期超过240 min,并可在55℃长时间反应而保持稳定,提高了具有复杂二级结构模板的逆转录成功率,可获得长至20 kb 的cDNA。同时,高温下保持的高活性能够带来更高的cDNA 产量。

组分

R201-01 (2000 U)

R201-01 (10000 U)

5×HiScript® II Buffer

500 μl

500 μl

HiScript® II Reverse Transcriptase (200 U/μl)

10 μl

50 μl

-30 ~ -15℃保存。

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗?

A1:可以。原核生物RNA没有polyA尾,所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。

Q2:逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix,可以去除残留在RNA中的基因组。最多可以去除多少的基因组?但如果不进行基因组去除,会影响接下来的逆转录吗?

A2:我们做过100ng基因组的测试,去除效率是99.95%。如果不进行基因组去除不会影响逆转录实验的进行,但是如果基因组残留严重但不去除的话,会影响接下来定量实验的准确性。

Q3:延长逆转录时间,是否可以提高逆转录效率?

A3:对于大多数基因,延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升;对于一些GC含量较高或含高级结构的模板,延长逆转录时间可提升逆转录效率。

Q4:做了No RT Control发现有gDNA残留怎么办?

A4:如果使用试剂盒中的gDNA wiper模块进行gDNA去除,但No RT Control仍有CT值,可通过实验组和No RT Control组的CT值来判断实验数据是否可用。当实验组CT值与No RT Control对照组CT值差值大于5,说明由gDNA导致的误差小于5%,则可以忽略gDNA污染;若实验组与对照组CT值差值小于3或者几乎一致,则实验组扩增产物的模板很大一部分来源于gDNA,这样的实验组就失去定量意义。

Q5:如何评判RNA质量?

A5:RNA质量从两个方面反应:

(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例,完整的总RNA有清晰的三条带,分子量从大到小分别为28S、18S、5S,并且28S是18S亮度的两倍;若能看见三条带,但带型模糊或弥散,则说明RNA有部分降解,此时请立即进行逆转录反应,并适量加大模板量;若只能看见分子量很小的一条带或没有条带,则 RNA 已完全降解,需要重新提取。

(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断,蛋白、离子等残留会使比值降低。

Q6:如何选择逆转录的引物?

A6:根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。

(1) 随机引物:随机结合在RNA的任何区域,适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

(2) Oligo dT:适用于具有PolyA尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾)。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上,所以对 RNA 样品的质量要求较高,即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

(3) 基因特异性引物:与模板序列互补,适用于序列已知的基因逆转录。

cDNA后续进行PCR扩增长片段,一般用Oligo dT或者基因特异性引物,不建议使用随机引物,因为随机引物是随机结合的,cDNA片段会偏短,可能会对长片段扩增造成稀释,后续扩增不出全长的目的基因;cDNA后续进行qPCR,一般使用Oligo dT和随机引物的混合物,可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。

Q7:可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗?

A7:不可以,逆转录产物cDNA是混合物,除了cDNA产物以外,还有buffer、逆转录酶、引物,同时还包含未转录的模板RNA,总RNA中的tRNA、rRNA等,都会干扰浓度测定结果,因此不能反应真实的cDNA产量。

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