HiScript II Reverse Transcriptase

Q1：原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗？

A1：可以。原核生物RNA没有polyA尾，所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。

Q2：逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix，可以去除残留在RNA中的基因组。最多可以去除多少的基因组？但如果不进行基因组去除，会影响接下来的逆转录吗？

A2：我们做过100ng基因组的测试，去除效率是99.95%。如果不进行基因组去除不会影响逆转录实验的进行，但是如果基因组残留严重但不去除的话，会影响接下来定量实验的准确性。

Q3：延长逆转录时间，是否可以提高逆转录效率？

A3：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升；对于一些GC含量较高或含高级结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。

Q4：做了No RT Control发现有gDNA残留怎么办？

A4：如果使用试剂盒中的gDNA wiper模块进行gDNA去除，但No RT Control仍有C_T值，可通过实验组和No RT Control组的C_T值来判断实验数据是否可用。当实验组C_T值与No RT Control对照组C_T值差值大于5，说明由gDNA导致的误差小于5%，则可以忽略gDNA污染；若实验组与对照组C_T值差值小于3或者几乎一致，则实验组扩增产物的模板很大一部分来源于gDNA，这样的实验组就失去定量意义。

Q5：如何评判RNA质量？

A5：RNA质量从两个方面反应：

(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则 RNA 已完全降解，需要重新提取。

(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD_260/280和OD_260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断，蛋白、离子等残留会使比值降低。

Q6：如何选择逆转录的引物？

A6：根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。

(1) 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

(2) Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

(3) 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。

cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。

Q7：可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？

A7：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。

Liu X ,Wei W,Li X , et al. (2017). BMI1 and MEL18 Promote Colitis-Associated Cancer in Mice via REG3B and STAT3.Gastroenterology.IF:18.392

Ju J, Chen A, Deng Y, et al. (2017).NatD promotes lung cancer progression by preventing histone H4 serine phosphorylation to activate Slug expression.[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):928.IF:12.124

Ding W, Liu WQ, Jia Y, et al. (2016). Biosynthetic investigation of phomopsins reveals a widespread pathway for ribosomal natural products in Ascomycetes.PNAS, 113(13):3521-3526. IF:9.674

Wang H, Liang L, Dong Q,et al.（2018）Long noncoding RNA miR503HG, a prognostic indicator, inhibits tumor metastasis by regulating the HNRNPA2B1/NF-κB pathway in hepatocellular carcinoma. Theranostics.IF:8.172

Zhang B, Wang M, Gong A, et al. (2015). HucMSC-exosome mediated -Wnt4 signaling is required for cutaneous wound healing. Stem Cells, 33(7):2158-2168.IF:7.133

Zhang Y, Du J, Zheng J, et al. (2015). EGF-reduced Wnt5a transcription induces epithelial-mesenchymal transition via Arf6-ERK signaling in gastric cancercells. Oncotarget. IF:6.627

Balamurugan S, Wang X, Wang H L, et al. (2017). Occurrence of plastidial triacylglycerol synthesis and the potential regulatory role of AGPAT in the model diatom Phaeodactylumtricornutum[J]. Biotechnology for Biofuels, 2017, 10(1):97.IF:6.444

Wang Y, Huang Y, Xu Y, et al. (2017).A Dual AMPK/Nrf2 Activator Reduces Brain Inflammation after Stroke by Enhancing Microglia M2 Polarization[J]. Antioxidants & Redox Signaling, 2017.IF:6.337

Gu J, Wang D, Zhang J, et al. (2016). GFRalpha2 prompts cell growth and chemoresistance through down-regulating tumor suppressor gene PTEN via Mir-17-5p in pancreatic cancer. Cancer Lett, 380(2), 434-441. IF:5.992

Wang Y, Ruan W, Mi J,et al. (2017).Balasubramide derivative 3C modulates microglia activation via CaMKKβ-dependent AMPK/PGC-1α pathway in neuroinflammatory conditions[J]. Brain Behavior & Immunity, 2017.IF:5.964

Si Z, Liu H, Zhu J, et al.（2018）Mutation ofSELF-PRUNINGhomologs in cotton promotes short-branching plant architecture:[J]. Journal of Experimental Botany, 2018, 69(10):2543-2553.IF：5.83

Zhu J, Chen J, Gao F, et al. （2017）Rapid mapping and cloning of the virescent-1 gene in cotton by bulked segregant analysis-next generation sequencing and virus-induced gene silencing strategies.[J]. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(15):4125.IF：5.83