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HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit

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R211-01/02
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¥
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HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 

高效cDNA 一链合成试剂盒

基于高效的HiScript® II Reverse Transcriptase,超强的温度耐受能力确保在高温条件下能打开RNA 复杂二级结构,得到更长的cDNA

宽广的模板起始量范围,从1 pg-5 μg 总RNA,并且可扩增片段长达15 kb 以上

Anchored Oligo(dT) 23 VN 设计结合位点锚定,特异性高,保证第一链cDNA 合成效率和成功率

针对不同下游应用选择不同的引物,合成的一链cDNA 广泛应用于分子克隆、杂交、PCR 扩增及qPCR 反应等

图1.R211可完整逆转录长达20 kb 的RNA 模板

以1 μg HeLa 细胞总RNA 或小鼠骨骼肌细胞总RNA (for Nebulin) 为模板,Oligo(dT) 23 VN为引物进行逆转录。

取1 μl cDNA 为模板,用Vazyme LAmp® DNA Polymerase 扩增。

M: DL 15000 Marker。

图2. R211 对qPCR 具有宽广且灵敏的线性逆转录范围

以1 μg-1 pg HeLa 细胞总RNA 为模板做逆转录,使用Random hexamers 和Oligo(dT) 23 VN 共同逆转录,取1 μl cDNA 为模板,分别用AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix 扩增ACTB 基因和CBR3 基因。

本产品是基于高效的HiScript® II Reverse Transcriptase 从总RNA 或Poly (A) + mRNA 合成一链cDNA 的试剂盒。含有一链cDNA 合成所需的全部试剂,其中HiScript® II Reverse Transcriptase 具有更高的cDNA 合成效率及模板的杂质耐受度,更加适合具有复杂二级结构或低丰度的RNA 模板的逆转录。Anchored Oligo (dT) 23 VN 设计结合位点锚定,特异性高,保证第一链cDNA 合成效率和成功率。合成的一链cDNA 可广泛应用于二链cDNA 合成、杂交、PCR 法扩增等。特别适用于全长cDNA文库制作、高纯度全长cDNA 合成等。

 

组分

R211-01 50 rxn (20 μl/rxn)

R211-02 100 rxn (20 μl/rxn)

RNase free ddH2O

1 ml

1 ml

2 ×RT Mixa

500 μl

1 ml

HiScript® II Enzyme Mixb

100 μl

200 μl

Oligo(dT)23VN (50 μM)

50 μl

100 μl

Random hexamers (50 ng/μl)

50 μl

100 μl

a. 包含1 mM each dNTP。

b. 包含RNase inhibitor。

-20℃保存。

未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗?

A1:可以。原核生物RNA没有polyA尾,所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。

Q2:逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix,可以去除残留在RNA中的基因组。最多可以去除多少的基因组?但如果不进行基因组去除,会影响接下来的逆转录吗?

A2:我们做过100ng基因组的测试,去除效率是99.95%。如果不进行基因组去除不会影响逆转录实验的进行,但是如果基因组残留严重但不去除的话,会影响接下来定量实验的准确性。

Q3:延长逆转录时间,是否可以提高逆转录效率?

A3:对于大多数基因,延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升;对于一些GC含量较高或含高级结构的模板,延长逆转录时间可提升逆转录效率。

Q4:做了No RT Control发现有gDNA残留怎么办?

A4:如果使用试剂盒中的gDNA wiper模块进行gDNA去除,但No RT Control仍有CT值,可通过实验组和No RT Control组的CT值来判断实验数据是否可用。当实验组CT值与No RT Control对照组CT值差值大于5,说明由gDNA导致的误差小于5%,则可以忽略gDNA污染;若实验组与对照组CT值差值小于3或者几乎一致,则实验组扩增产物的模板很大一部分来源于gDNA,这样的实验组就失去定量意义。

Q5:如何评判RNA质量?

A5:RNA质量从两个方面反应:

(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例,完整的总RNA有清晰的三条带,分子量从大到小分别为28S、18S、5S,并且28S是18S亮度的两倍;若能看见三条带,但带型模糊或弥散,则说明RNA有部分降解,此时请立即进行逆转录反应,并适量加大模板量;若只能看见分子量很小的一条带或没有条带,则 RNA 已完全降解,需要重新提取。

(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断,蛋白、离子等残留会使比值降低。

Q6:如何选择逆转录的引物?

A6:根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。

(1) 随机引物:随机结合在RNA的任何区域,适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

(2) Oligo dT:适用于具有PolyA尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾)。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上,所以对 RNA 样品的质量要求较高,即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

(3) 基因特异性引物:与模板序列互补,适用于序列已知的基因逆转录。

cDNA后续进行PCR扩增长片段,一般用Oligo dT或者基因特异性引物,不建议使用随机引物,因为随机引物是随机结合的,cDNA片段会偏短,可能会对长片段扩增造成稀释,后续扩增不出全长的目的基因;cDNA后续进行qPCR,一般使用Oligo dT和随机引物的混合物,可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。

Q7:可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗?

A7:不可以,逆转录产物cDNA是混合物,除了cDNA产物以外,还有buffer、逆转录酶、引物,同时还包含未转录的模板RNA,总RNA中的tRNA、rRNA等,都会干扰浓度测定结果,因此不能反应真实的cDNA产量。

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