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    2020-06-30 23:37:24
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HiScript II Q RT SuperMix for qPCR

HiScript®IIQRTSuperMixforqPCR  预混液形式的两步法RT-qPCR首选试剂 ·基于高效的HiScript®IIReverseTranscriptase,逆转录效率更高·AnchoredOligo(dT)23VN设计独特,确保反应特异性,提高第一链cDNA合成效率和成功率 ·即用型的SuperMix预混液使用方便省时  以HeLa细胞总RNA为模板,使用Vazyme#R2
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说明书

HiScript® II Q RT SuperMix for qPCR 

预混液形式的两步法RT-qPCR 首选试剂

基于高效的HiScript® II Reverse Transcriptase,逆转录效率更高

Anchored Oligo (dT)23 VN 设计独特,确保反应特异性,提高第一链cDNA 合成效率和成功率

即用型的SuperMix 预混液使用方便省时

以HeLa 细胞总RNA 为模板,使用Vazyme #R222 和SupplierT 同类产品,在各自说明书所提供的反应体系及反应条件下逆转1 pg-1 ug 总RNA,然后用qPCR 检测基因ACTB 和B2M。结果表明与同类产品相比,Vazyme #R222 在扩增效率和扩增线性上表现都较优异。

本产品是以高性价比的HiScript® II Reverse Transcriptase 为基础的两步法qPCR 试剂盒。比例优化的Random primers/Oligo(dT)23  VN primer mix,使cDNA 合成可从RNA 转录本的各个区域起始并具有相同的逆转录效率,最大程度保证了qPCR 结果的真实性和可重复性。本试剂盒为即用型的SuperMix,将合成高质量第一链cDNA 所需的所有成分合并为一管5 × SuperMix,同时对反应体系进行大幅简化,只需加入RNA 和水即可进行逆转录反应,且SuperMix 在-20℃不会冻结,使用方便。

组分

R222-01    100 rxn (20 μl/rxn)

RNase free ddH2O

2 × 1 ml

5 × HiScript®II qRT SuperMixa

400 μl

5 × No RT Control Mixb

40 μl

a. 包含Buffer、dNTP、HiScript®II Reverse Transcriptase、RNase inhibitor、Random primers/ Oligo (dT) 23 VN primer mix。

b. 除不含HiScript®II Reverse Transcriptase 外,其余成分与5 × HiScript®II qRT SuperMix 相同,用于配制No RT Control 反应。

-30 ~ -15℃保存。

关键词:
R222-01
预混液形式的两步法RT-qPCR首选试剂
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Q1:原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗?

A1:可以。原核生物RNA没有polyA尾,所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。

Q2:逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix,可以去除残留在RNA中的基因组。最多可以去除多少的基因组?但如果不进行基因组去除,会影响接下来的逆转录吗?

A2:我们做过100ng基因组的测试,去除效率是99.95%。如果不进行基因组去除不会影响逆转录实验的进行,但是如果基因组残留严重但不去除的话,会影响接下来定量实验的准确性。

Q3:延长逆转录时间,是否可以提高逆转录效率?

A3:对于大多数基因,延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升;对于一些GC含量较高或含高级结构的模板,延长逆转录时间可提升逆转录效率。

Q4:做了No RT Control发现有gDNA残留怎么办?

A4:如果使用试剂盒中的gDNA wiper模块进行gDNA去除,但No RT Control仍有CT值,可通过实验组和No RT Control组的CT值来判断实验数据是否可用。当实验组CT值与No RT Control对照组CT值差值大于5,说明由gDNA导致的误差小于5%,则可以忽略gDNA污染;若实验组与对照组CT值差值小于3或者几乎一致,则实验组扩增产物的模板很大一部分来源于gDNA,这样的实验组就失去定量意义。

Q5:如何评判RNA质量?

A5:RNA质量从两个方面反应:

(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例,完整的总RNA有清晰的三条带,分子量从大到小分别为28S、18S、5S,并且28S是18S亮度的两倍;若能看见三条带,但带型模糊或弥散,则说明RNA有部分降解,此时请立即进行逆转录反应,并适量加大模板量;若只能看见分子量很小的一条带或没有条带,则 RNA 已完全降解,需要重新提取。

(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断,蛋白、离子等残留会使比值降低。

Q6:如何选择逆转录的引物?

A6:根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。

(1) 随机引物:随机结合在RNA的任何区域,适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

(2) Oligo dT:适用于具有PolyA尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾)。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上,所以对 RNA 样品的质量要求较高,即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

(3) 基因特异性引物:与模板序列互补,适用于序列已知的基因逆转录。

cDNA后续进行PCR扩增长片段,一般用Oligo dT或者基因特异性引物,不建议使用随机引物,因为随机引物是随机结合的,cDNA片段会偏短,可能会对长片段扩增造成稀释,后续扩增不出全长的目的基因;cDNA后续进行qPCR,一般使用Oligo dT和随机引物的混合物,可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。

Q7:可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗?

A7:不可以,逆转录产物cDNA是混合物,除了cDNA产物以外,还有buffer、逆转录酶、引物,同时还包含未转录的模板RNA,总RNA中的tRNA、rRNA等,都会干扰浓度测定结果,因此不能反应真实的cDNA产量。

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