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  • 产品名称: Hiscript Reverse Transcriptase
  • 产品编号: R101-01/02
    • 产品规格: 2000 U 10000 U

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Hiscript Reverse Transcriptase

性能优化的逆转录酶

 

提高热稳定性,可耐受50℃的反应温度,适用于二级结构的RNA模板

增强与模板的亲和力,可获得更多全长的cDNA

高度灵敏,可检测到低至1 pg的总RNA

降低了逆转录过程的出错率,提高克隆的保真度

 

图1. HiScript® Reverse Transcriptase可逆转录低至1 pg总RNA用于PCR反应。

使用不同逆转录酶在50℃反应30分钟,将100 ng至1 pg小鼠肝脏总RNA 逆转录为cDNA。取1/10 cDNA为模板,用AceTaq® DNA Polymerase扩增β-Actin基因。NTC: no template control. 

 

      HiScript® Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过多点突变得到的全新逆转录酶。HiScript® Reverse Transcriptase在50℃下活性最高,且可耐受高达55℃的反应温度,可用于具有二级结构的RNA模板的逆转录。增强与模板的亲和力,可获得更多全长的cDNA,并可检测到低至1 pg的总RNA,特别适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。此外HiScript® Reverse Transcriptase的错配率也比M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase有所降低,提高了克隆的保真度。

组分说明:

组分

R101-01 (2000 U)

R101-01 (10000 U)

5×HiScript® Buffer

500 μl

500 μl

HiScript® Reverse Transcriptase (200U/μl)

10 μl

50 μl

贮藏条件: -20℃保存。

 

质量控制

核酸外切酶残留检测:2000 U的本酶和50 μM 3’和5’突出退火双链产物在37℃下孵育16 h,DNA的电泳谱带不发生变化。

 

核酸内切酶残留检测:2000 U的本酶和0.3 μg质粒A在37℃下孵育4 h,DNA的电泳谱带不发生变化。

 

RNase残留检测:2000 U的本酶和1 μg HeLa细胞总RNA在37℃下孵育30 min,RNA电泳谱带不发生变化。

 

大肠杆菌DNA残留检测:200 U本品中残留的核酸经E.coli gDNA特异性的TaqMan探针qPCR检测,E.coli基因组残留低于10拷贝。

 

功能检测:逆转录体系中加入200 U本酶,以1 μg Hela细胞总RNA为模板,Oligo (dT)18为引物,42℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增VIN基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的4.6 kb条带。

注意事项:

1. 防止RNA酶污染

请保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证为RNase-free。

 

2. 引物选择

(1)后续实验为PCR

 

 

 

· 如果模板为真核生物来源,一般情况下首选Oligo dT,与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA。

 

· 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下,用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时,可改用Oligo dT或Random hexamers重新进行逆转录。

 

· Random hexamers特异性最低,所有RNA,包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高,或者模板为原核生物来源,使用Oligo dT或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时,均可使用Random hexamers为引物。

 

(2)后续实验为qPCR

 

将Oligo dT与Random hexamers混合使用,可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同,有助于提高定量结果的真实性和重复性。

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