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  • 产品名称: HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit
  • 产品编号: R111-01/02
    • 产品规格: 50 rxn(20 μl/rxn) 100 rxn(20 μl/rxn)

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HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit

高性价比cDNA一链合成试剂盒

 

HiScript® Reverse Transcriptase提供可靠的逆转录表现

宽泛的模板量范围可成功逆转录从10 pg-5 μg总RNA

• 高效的合成能力:可合成长达10 kb的cDNA

针对不同下游应用可选择不同引物,合成的一链cDNA可广泛应用于分子克隆、杂交、PCR扩增及qPCR反应等

• 操作简便快捷

 

HiScript® Reverse Transcriptase是在M-MLV (Moloney Murine Leukemia virus) 基础上经过多点突变得到的新型逆转录酶。该酶能够有效合成长达10 kb的cDNA,适用于常规RNA、富含GC区域或具有复杂二级结构RNA模板的逆转录。HiScript® 一链cDNA合成试剂盒基于HiScript® Reverse Transcriptase,包含合成高质量第一链cDNA所需的所有成分,适合于后续的PCR、qPCR实验。

组分说明:

组 分

R111-01 50 rxn (20 μl/rxn)

R111-02 100 rxn (20 μl/rxn)

RNase free ddH2O

1 ml

1 ml

2 ×RT Mixa

500 μl

1 ml

HiScript® Enzyme Mixb

100 μl

200 μl

Oligo(dT)18 (50 μM)

50 μl

100 μl

Random hexamers (50 ng/μl)

50 μl

100 μl

a. 包含1 mM each dNTP。

b. 包含RNase inhibitor、HiScript® Reverse Transcriptase.

 

贮藏条件: -20℃。

 

质量控制

核酸外切酶残留检测:2000 U的本酶和50 μM 3'和5'突出退火双链产物在37℃下孵育16 h,DNA的电泳谱带不发生变化。

 

核酸内切酶残留检测:2000 U的本酶和0.3 μg质粒A在37℃下孵育4 h,DNA的电泳谱带不发生变化。

 

RNase残留检测:2000 U的本酶和1 μg HeLa细胞总RNA在37℃下孵育30 min,RNA电泳谱带不发生变化。

 

大肠杆菌DNA残留检测:200 U本品中残留的核酸经E.coli gDNA特异性的TaqMan探针qPCR检测,E.coli基因组残留低于10拷贝。

 

功能检测1:逆转录体系中加入200 U本酶,以1 μg HeLa细胞总RNA为模板,Oligo (dT)23为引物,42℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增VIN基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的4.6 kb条带。

 

功能检测2:逆转录体系中加入200 U本酶,以1 pg HeLa细胞总RNA为模板,Oligo (dT)23为引物,50℃反应30 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增GAPDH基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的550 bp条带。

 

功能检测3:以500 ng HeLa细胞总RNA为模板,以Oligo (dT)23VN为引物,55℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的7.1 kb (GC-rich)条带。

 

功能检测4:以1 pg-1 µg HeLa细胞总RNA为模板,以Oligo (dT)23VN和Random hexamers为引物,qRT-PCR测试高中低三种丰度七个基因表达。以6个数量级模板量的对数值对CT值做标准曲线并计算扩增效率,R2>0.990,扩增效率在0.95到1.05之间。

注意事项:

1. 防止RNA酶污染

请保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证为RNase-free。

 

2. 引物选择

(1)后续实验为PCR

· 如果模板为真核生物来源,一般情况下首选Oligo dT,与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA。

 

· 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。当GSP无法有效引导第一链cDNA合成,可改用Oligo dT或Random hexamers重新进行逆转录。

 

· Random hexamers特异性最低,所有RNA,包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构、GC含量较高,或者模板为原核生物来源时,Oligo dT或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成,可使用Random hexamers为引物。

 

(2)后续实验为qPCR

 

将Oligo dT与Random hexamers混合使用,可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同,有助于提高定量结果的真实性和重复性。

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