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转录组重测序
 

技术简介
     转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA的总和。转录组研究是基因功能及基因结构等研究的基础,通过新一代高通量测序,能够全面快速的获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,已广泛应用于临床诊断、基础研究和药物研发等领域。

     转录组Resequencing针对的是有参考基因组的物种。用新一代高通量测序技术对某物种的特定组织或细胞进行转录组测序,与参考基因组比较,可以得到基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。
 

技术优势
●  通量高:每个样品4G以上的数据产出量,海量数据用于分析 
●  覆盖度高:能覆盖到几乎所有转录本片段的序列  
●  分辨率高:单碱基分辨率
●  检测阈值广:从几个到数十万个拷贝精确计数,可同时鉴定及定量正常和稀有转录本
●  分析有深度:可鉴定RNA编辑、可变剪接、基因融合等转录水平调控现象
●  数字化信号:单核苷酸分辨率的精确度,不存在传统微阵列杂交的模拟信号带来的交叉反应和背景噪音
 

技术流程

                      

信息分析内容

标准信息分析
1.对原始数据进行去除接头污染序列及低质量 reads 的处理
2.测序评估(比对统计、测序随机性评估、Reads在基因组上的分布)
3.基因表达注释(基因覆盖度、覆盖深度分布等)
4.基因差异表达分析(两个或两个以上样品)
5.差异基因的表达模式聚类分析(需要确定对符合哪些条件的差异表达基因做聚类分析)
6.差异表达基因GO功能富集分析
7.差异表达基因Pathway显著性富集分析
8.对基因结构进行优化
9.鉴定基因的可变剪接
10.新转录本预测及注释
11.SNP分析
个性化信息分析(≥5个样本)
1.融合基因分析
2.基因共表达分析

 

数据量
6G clean data/样本
 
样本要求
1. 样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品
2. 样品需求量:细胞样品≥1×107个,动物组织≥1g,植物组织≥2g,总RNA≥10 μg
3. 样品浓度:RNA样品≥100 ng/μl
4. 样品纯度:OD260/OD280在1.8-2.2之间,OD260/OD230≥2,28S/18S≥1,动物样品RIN≥7.0,植物样品RIN≥6.5,RNA无明显降解
 
 
项目运转周期
标准流程的运转周期为约40个工作日


案例分析


基于RNA-seq的转录组重测序揭示中国人群前列腺癌相关的融合基因、lncRNAs和异常可变剪切


前列腺癌患者具有显著的种群差异,而引起差异的机制并不清楚。该研究展示了来自中国人群14个个体原发前列腺癌样本以及它们的正常组织对照样本基于RNA-seq的转录组重测序成果。2个新的基因融合现象(CTAGE5-KHDRBS3,USP9Y-TTTY15)在本研究的前列腺癌个体中普遍存在,而另外1个已经报道过的基因融合现象(TMPRSS2-ERG)在中国患者中的发生频率并不高(图1)。进一步的系统性转录组分析在癌症组织中发现了大量存在差异表达的lncRNAs,且lncRNA与基因间表达量的分析表明lncRNA可能具有不仅限于转录调控的作用(图2)。该研究为中国人群前列腺癌的发病机制提供了新的视野。

                    

图1:基因融合现象展示及验证

图2:lncRNA差异表达聚类、lncRNA与基因关联热图以及lncRNA的qRT-PCR验证

 

 

参考文献
Ren S, Peng Z, Mao JH, Yu Y, Yin C, et al. RNA-seq analysis of prostate cancer in the Chinese population identifies recurrent gene fusions, cancer-associated long noncoding RNAs and aberrant alternative splicing. Cell Res. 2012 May;22(5):806-21.


FAQ
Q-1:什么是转录组及转录组测序?
A-1:转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,包括mRNA 和非编码RNA(即Non-coding RNA,如 tRNA,rRNAs,microRNAs,piRNAs和 long ncRNAs等)。转录组测序(Transcriptome sequencing)主要通过高通量测序研究特定组织或细胞在某个时期转录出来的mRNA。

 

Q-2:做转录组测序一般需要测多大的数据量?
A-2:测多少数据量需要结合研究目的和基因组大小来看,对绝大多数动植物来说4G的数据可以进行常规的生物信息分析。如果需要研究低丰度的转录本,或者想拼出一套比较完整的转录组,建议您选8G或更高的数据量。


Q-3:转录组测序是否需要生物学重复?
A-3:有必要,至少需要两次生物学重复,3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。


Q-4:转录组测序能否使用 LiCl沉淀RNA?
A-4:可以使用LiCl进行沉淀,虽然LiCl会使小分子RNA部分丢失但并不影响转录组测序分析。如果同一样品还要进行小分子RNA 分析,在提取总RNA时请不要使用LiCl沉淀.

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