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Small RNA测序
 

 

技术简介
     Small RNA是生物体内一类重要的调节分子,长度在18-30nt之间,主要包括miRNA、siRNA和piRNA。它的功能主要是诱导基因沉默,参与调控基因表达、生长发育、非生物胁迫和病原菌的侵害等过程。Small RNA测序利用高通量测序技术,研究特定组织在特定状态下的所有已知small RNA,也可发现物种或组织特异small RNA 并预测其靶基因,为研究small RNA 的功能及基因调控机制提供了有力工具。

 

技术优势
●  通量高:一次测序得到1000万条以上的序列
●  高分辨率:可检测small RNA单个碱基差异
●  高精准度:从几个到数十万个拷贝精确计数
●  运用范围广:可与基因表达谱测序或者转录组测序等结合使用,以便从多角度同时解释相关生理过程
●  良好的重复性:深度测序保证了抽样的随机性,重复性非常好,无需技术重复

 

 技术流程
                            

 

信息分析内容


标准信息分析
数据产出统计,对原始测序数据去接头污染,去低质量 reads
18-30 nt small RNA 测序结果的长度分布
样品间的公共序列和特异序列的分析(2 个或2个样品以上)
Small RNA 在选定的参考基因组上的分布
Small RNA 与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 的比对信息
Small RNA 与重复序列的比对信息
Small RNA 与exon/intron的比对信息
Small RNA 与miRBase中指定范围的已知的 miRNA 的比对
已知miRNA 的表达谱构建
按照优先级将 small RNA 进行分类注释
利用 Mireap 对没有注释的small RNA进行预测,预测新的miRNA,绘制新的miRNA 的二级结构图
已知 miRNA 的家族分析
已知 miRNA和novel miRNA 的靶基因预测
已知 miRNA和novel miRNA靶基因GO注释和KEGG
已知 miRNA的碱基编辑分析
已知 miRNA 差异分析(2个或 2个以上样品)和聚类分析(3 个或 3个以上样品)
novel miRNA 差异分析(2个或 2个以上样品)和聚类分析(3个或 3 个以上样品)
差异 miRNA 靶基因预测(需要提供基因编码序列,2 个或2个以上样品)
差异miRNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析 (2 个或2个以上样品)


个性化信息分析
mRNA与smallRNA联合分析
 

 

 

数据量
10M clean reads/样本


 样本要求
1、 样品类型:去蛋白并进行Dnase处理后的完整无污染总RNA
2、 样品需求量:≥5 μg
3、 样品浓度:≥200 ng/μl
4、 样品纯度:OD260/OD280在1.8-2.2之间,OD260/OD230≥2,28S/18S≥1.5, RIN≥8.0, RNA无明显降解
5、 样品保存:请选择乙醇、DEPC水保存样品,并在样品信息单中注明,请勿反复冻融。
 

项目运转周期
标准流程的运转周期为约35个工作日

 

 

 

案例分析
基于深度测序的宫颈癌患者新型血清microRNA的鉴别和定性
小非编码microRNAs(miRNAs)参与癌症的发展与演化,而宫颈癌患者的血清可能用于新miRNAs的鉴别。该研究对3个重复宫颈癌患者和健康对照的血清进行深度测序,并且创建了一个小RNA文库。然后,利用MIREAP预测新miRNAs,且经过使用Triplet-SVM分析过滤掉假miRNA前体(pseudo-pre-miRNAs),在宫颈癌患者和健康对照之间找到了2个新的候选miRNAs。这2个候选miRNAs经过实时定量PCR得到了验证,且相对于健康对照,它们的表达在癌症患者中显著降低(图1)。其中一个候选miRNAs在宫颈癌患者和健康对照之间的差异敏感性为85.7%,特异性为88.2%(图2)。该研究表明深度测序定性宫颈癌血清可以鉴定新的miRNAs,且经过验证的新miRNAs可以作为宫颈癌的生物标记物。

 


                 

                                                        图1:2个新miRNAs的RT-PCR验证

 

 

                  

                                               图2:宫颈癌诊断SCC以及2个新miRNAs的ROC曲线图

 

 

参考文献
Juan L. Tong HL, Zhang P, Guo G, et al. Identification and characterization of novel serum microRNA candidates from deep sequencing in cervical cancer patients. Sci Rep. 2014 Sep 3;4:6277.

 

FAQ
Q-1:小 RNA测序对样品提取有什么要求?
A-1:
small RNA测序要求提供总量≥5 μg、浓度≥200 ng/μl,RIN≥8.0的RNA样本;提取总 RNA 时请避免使用过柱法和 LiCI 沉淀,以防止小 RNA 丢失。


Q-2:为什么小RNA的数据中会存在一部分mRNA序列?
A-2:
由于 total RNA 常发生轻微的降解,而生物体内也有自然的降解过程,因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低,并且取决于样品 total RNA 的质量。


Q-3:做small RNA测序项目,客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息?
A-3:
需要提供相应物种的基因组和相关的 exon、intron、repeat 信息。如果没有本物种的基因组,可以提供近缘物种的相关信息。
 

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