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单细胞转录组测序

技术介绍

 

单细胞转录组测序是指利用高通量测序手段对单个细胞的转录组进行扩增与测序的一项新技术,其原理是将分离的单个细胞或微量RNA 扩增后进行高通量测序,为解析单个细胞的行为(如胚胎细胞和干细胞)、细胞分子机制(如肿瘤细胞异质性)等提供新方向;成功解决了细胞分子机制研究中常见的细胞异质性、细胞量少而无法进行常规高通量测序等难题。

 

技术优势

 

单细胞级别起始量

样品扩增上百万倍

技术稳定重复性高

 

技术流程

 

信息分析内容

 

标准信息分析

1) 对原始数据进行去除接头污染序列及低质量reads 的处理

2) 测序评估(比对统计、测序随机性评估、Reads在基因组上的分布)

3) 基因表达注释(基因覆盖度、覆盖深度分布等)

4) 基因差异表达分析(两个或两个以上样品)

5) 差异基因的表达模式聚类分析(需要确定对符合哪些条件的差异表达基因做聚类分析)

6) 差异表达基因GO功能富集分析

7) 差异表达基因Pathway显著性富集分析

8) 对基因结构进行优化

9) 蛋白互作网络分析

10) 鉴定基因的可变剪接

11) 新转录本预测及注释

12) 融合基因分析

13) SNP/InDel分析

 

个性化信息分析

1) 组成分分析

2) 共表达网络分析

数据量

6G clean data/样本

 

样本要求

细胞分离:由合作方完成单个细胞分离

样本类型:活体新鲜完整单个细胞,不适于经固定、染色等处理的样本,建议重复单细胞样本个数≥ 5 个

细胞样品分选入装有10×sample buffer 缓冲液的200 μl nuclease-free PCR 管中,总体积不超过6 μl

 

项目运转周期

标准流程的运转周期约为45个工作日

案例分析

 

单细胞转录组测序在治疗转移型肾细胞癌联药方案选择中的应用

靶向治疗可以特异性杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞,但由于肿瘤细胞的异质性,使得靶向作用于特定标记基因的药物疗效下降。因此,优化肿瘤治疗方案,缩短各类肿瘤细胞的生命周期,使靶向药物对肿瘤的治疗长期有效具有重要意义。本研究选取了根治性肾切除治疗一年后,发生肺转移的43岁男性患者的原发癌细胞及肺转移癌细胞为实验材料进行了单细胞转录组测序研究。

研究表明单细胞转录组测序有助于克服肿瘤异质性对药物疗效的影响,在抗肿瘤药物方案确定方面有着重要的作用。基于预测到的多位点通路的激活,研究者通过采用靶向两个独立的不同通路联合用药的方案来治疗转移癌,这种治疗方式通过移植瘤模型的体内体外实验,证实联合用药相对于单药,显著提高了肿瘤的治疗效果。通过单细胞转录组测序制定靶向药物治疗方案,为癌症的治疗提供了新思路,为靶向药物的长期有效性提供了重要保障。

图1. 单细胞建库测序流程及药物治疗优化方案

 

参考文献

Application of single-cell RNA sequencing in optimizing a combinatorial therapeutic strategy in metastaticrenal cell carcinoma. Genome Biology, 2016.

FAQ

 

Q-1:单细胞转录组测序,有哪些送样方法?

A-1:单细胞送样有以下几种方法:

1)吸取单细胞样品(体积不超过5μl)保存于含有1μl 10×sample buffer的0.2 ml无RNA酶EP管中,干冰运输。

2)购买我们的N711试剂盒,由合作方自己反转成cDNA后送样,干冰运输。

 

Q-2:单细胞转录组测序,合作方获取单个细胞有困难,能送上百个细胞样品吗?

A-2:单细胞送样时,吸取出的单细胞样品(体积不超过5 μl)保存于含有1 μl

10×sample buffer的0.2ml无RNA酶EP管中,干冰运输。若合作方吸取上百个细胞样品,体积也不能超过5μl,且要保证每组吸取的细胞数量一样,以免细胞数量不一致对后续扩增造成影响。

 

Q-3:单个细胞转录组扩增效果如何?

A-3:单个细胞转录组进行扩增,使用诺唯赞自主研发试剂盒,该试剂盒应用逆转录酶的template-switching活性在逆转录的全长cDNA3’末端(即相应的mRNA的5’末端)加上一段接头序列,这段接头序列可用于全长cDNA 的扩增进而得到整个mRNA的序列,从而有效避免了3’偏好,实现单细胞转录组和微量RNA 的高覆盖度的扩增并可得到足够的可用于二代测序的双链DNA。

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