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转录组de novo测序

 

技术简介

     转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA的总和。转录组研究是基因功能及基因结构等研究的基础,通过新一代高通量测序,能够全面快速的获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,已广泛应用于临床诊断、基础研究和药物研发等领域。
 
     转录组De novo测序也称为转录组从头测序,不需要任何参考转录组序列资料,即可对某物种特定组织或细胞的转录本进行测序,用生物信息学分析方法进行拼接和组装,从而获得该物种相关的转录本信息。
 

技术优势

●  覆盖度高:直接测定几乎所有转录本片段序列  
●  分辨率高:可以检测基因家族中相似基因及可变剪接造成的单碱基及序列差异
●  鉴定范围广:可同时鉴定表达正常和稀有的转录本
●  任意物种的全转录组分析:无需设计特异性探针,无需任何参考序列信息,直接进行最全面的转录组分析
 

技术流程

                        

 

 

信息分析内容
 

标准信息分析
1.对原始数据进行去除接头序列及低质量reads的处理 
2.数据产出统计及测序数据的成分和质量评估 
3.组装结果分析(Contig长度分布、Unigene长度分布) 
4.Unigene功能注释及COG分类 
5.Unigene的GO分类 
6.Unigene代谢通路分析 
7.预测编码蛋白框(CDS) 
8.Unigene表达差异分析(两个或两个以上样品) 
9.Unigene在样品间的差异GO分类(需两个或两个以上样品)和Pathway富集性分析 
10.SNP分析 
11.SSR开发及引物设计
 
个性化信息分析(≥5个样品)
1.条件特异表达分析(适用于真核生物)
2.主成分分析
 
样本要求
1.样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品
2.样品需求量:细胞样品≥1×107个,动物组织≥1g,植物组织≥2g,总RNA≥10 μg
3.样品浓度:RNA样品≥100 ng/μl
4.样品纯度:OD260/OD280在1.8-2.2之间,OD260/OD230≥2,28S/18S≥1,动物样品RIN≥7.0,植物样品RIN≥6.5,RNA无明显降解
 
 
项目运转周期
标准流程的运转周期为约40个工作日
 
案例分析

转录组De novo测序以及差异表达基因分析揭示杏树对于冻结压力的应激反应

 

杏树(Prunus dulcis Mill.),最重要的坚果作物之一,需要冬季的低温促进果芽萌发。然而,早春低温和晚春霜降可能损坏繁殖组织,导致生产率下降。此前,冻结压力下杏树转录组的研究较为匮乏,本研究利用RNA-seq技术探索杏树繁殖组织(花药和子房)对于冻结压力的应激反应。通过组装及注释,每种组织均得到约40000条contigs。在冻结压力下,子房中5112个基因的表达显示显著变化,而花药中,6926个基因的表达被影响,其中,共有的有表达变化的基因大约有2000个(图1)。GO(Gene ontology)显示对冻结压力有应激反应的差异表达(DE,differentially expressed)基因富集到代谢和细胞过程(metabolic and molecular processes)。从这些差异表达基因中,随机挑选8个基因,使用qRT-PCR进行验证(图2)。该研究中组装的contigs以及差异表达基因可用于杏树和其他李属物种在非生物压力下应激反应的探索。

 

 

图1:杏树两种组织中的差异表达基因数以及共有差异表达基因数统计

 

 

 

 

图2:8个差异表达基因的qRT-PCR验证

 

参考文献
Mousavi S1, Alisoltani A1, Shiran B2, Fallahi H3, Ebrahimie E4,et al. De Novo Transcriptome Assembly and Comparative Analysis of Differentially Expressed Genes in Prunus dulcis Mill. in Response to Freezing Stress. PLoS One. 2014; 9(8): e104541.
 

FAQ
Q-1:什么是转录组及转录组测序?
A-1:转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,包括mRNA 和非编码RNA(即Non-coding RNA,如 tRNA,rRNAs,microRNAs,piRNAs和 long ncRNAs等)。
转录组测序(Transcriptome sequencing)主要通过高通量测序研究特定组织或细胞在某个时期转录出来的mRNA。


Q-2: 做转录组测序一般需要测多大的数据量?
A-2: 测多少数据量需要结合研究目的和基因组大小来看,对绝大多数动植物来说4G的数据可以进行常规的生物信息分析。如果需要研究低丰度的转录本,或者想拼出一套比较完整的转录组,建议您选8G或更高的数据量。

 

Q-3: 转录组测序是否需要生物学重复?
A-3: 有必要,至少需要两次生物学重复,3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。


Q-4: 转录组测序能否使用 LiCl沉淀RNA?
A-4: 可以使用LiCl进行沉淀,虽然LiCl会使小分子RNA部分丢失但并不影响转录组测序分析。如果同一样品还要进行小分子RNA 分析,在提取总RNA时请不要使用LiCl沉淀。

 

Q-5: 为什么有时候转录组de novo拼接注释后,得到的注释基因非常少?
A-5: 注释基因的多少跟您所研究的物种直接相关,如某些比较重要的物种基因研究的比较多,功能也比较清楚,注释得到的基因就会很多;反之则会比较少。

 

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