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重磅 | ChIP-qPCR太麻烦?看CUT&Tag如何弯道超车!

  • 分类:市场动态
  • 作者:
  • 来源:
  • 发布时间:2023-11-30 15:50
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【概要描述】

重磅 | ChIP-qPCR太麻烦?看CUT&Tag如何弯道超车!

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在表观遗传学中,传统的蛋白质-DNA互作研究技术ChIP和CUT&Tag在二代测序技术的加持下大放异彩,通过文库构建和丰富的生物信息学分析,能够在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的 DNA 区段。但整个实验流程费时费力,对于某些特定基因位点的检测,二代测序的成本较高,搭配速度快、成本低的qPCR是更明智的选择。

qPCR在关注特定基因和潜在调控区域的研究中具有成本低、实验限制少的优势,可应用于发育生物学,肿瘤机制研究以及组蛋白修饰对基因表达的影响等。但实现CUT&Tag-qPCR也并非易事,因为CUT&Tag的技术路线与ChIP有所不同,在ChIP实验中,被抗体特异性抓取的片段一般是目的基因片段,因此可以直接进行qPCR检测。而在传统的CUT&Tag实验流程中,是通过裂解细胞,回收全基因组,并扩增带有Tn5粘贴接头的DNA片段,达到对目的DNA片段进行文库构建的目的。因此,CUT&Tag兼容qPCR的关键点和难点在于回收的片段必须是被Tn5切割的目的片段。

图1. 蛋白质-DNA互作研究技术实验流程

a、ChIP-seq,b、CUT&RUN-seq,c、CUT&Tag-seq。

(Kaya-Okur HS, Henikoff S. ,Nat Protoc, 2020 )

 

CUT&Tag Pro试剂盒(Vazyme #TD904)进行了定向优化,可以同时兼容建库和qPCR——核心酶pA/G-Tnp和DNA提取磁珠的联合升级,实现了靶向切割、特异性回收目的片段的功能。使用TD904仅需5分钟,即可释放DNA Extract Beads Pro抓取到的目的DNA片段,以其为模板进行qPCR检测,判断目的基因是否有富集。同时,通过TD904获得的模板适用于各种qPCR试剂和程序。

与ChIP-qPCR相比,CUT&Tag-qPCR兼容低细胞投入量、不需要交联、超声打断等步骤,操作难度更小、耗时更短、抗体兼容性更强。在Vazyme CUT&Tag系列试剂盒中,只有TD904可以对目的基因进行qPCR检测,如果有这方面的实验需求,千万不要选错试剂盒了哟!

图2. CUT&Tag试剂盒提取技术原理

 

CUT&Tag Pro试剂盒(Vazyme #TD904)在不同细胞投入量的293细胞中对组蛋白H3K4me3体系进行了CUT&Tag-qPCR实验,本试剂盒可兼容100 - 100,000细胞,在低细胞投入量下仍有良好表现。对于不同丰度的靶点我们也对多个目的基因设计了引物进行检测,相较于阴性对照IgG,实验组中目的基因均有显著富集。

图3. 不同细胞投入量下CUT&Tag-qPCR实验结果

(A)不同细胞投入量下Positive Control CT值,(B)不同细胞投入量下DNA Spike-in CT值,(C)和(D)Positive Control相较于IgG的相对富集倍数。

图4. 不同靶蛋白CUT&Tag-qPCR实验结果

 

由于应用方向和技术原理的相似性,CUT&Tag-qPCR的数据计算方式和结果体现形式可以参照ChIP-qPCR。ChIP-qPCR两种主流的计算方法包括Percent Input法和Fold Enrichment法。Percent Input法需要引入CUT&Tag实验流程并不需要的Input,因此不适用于CUT&Tag-qPCR的实验结果计算。Fold Enrichiment法引入了IgG,IgG理论上是不能特异性富集任何DNA片段,因此IgG可以作为阴性对照参与计算富集倍率,这不仅能够用于对照组和处理组相对富集倍率的计算,也能够满足单组单基因的富集验证,计算方法与常规qPCR类似,采用2-△△CT法对CT值进行处理和计算,通过数据分析软件(如SPSS)比较阴性对照组和实验组之间是否存在显著差异。

图5. Fold Enrichiment法数据形式

(Hong Liu, Cancer Cell, 2020)

 

诺唯赞提供两种可同时进行CUT&Tag文库构建和qPCR的方案,可在Vazyme官网TD904详情页中查询CUT&Tag-qPCR的实验流程和所需试剂。

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