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    T7 RNAi Transcription Kit-V21.1.pdf

    大小:
    2021-04-09 17:25:53
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3718

T7 RNAi Transcription Kit

T7RNAiTranscriptionKit用于体外dsRNA合成可以转录siRNA和长片段dsRNA;产量高达20-80μg;RNA磁珠可快速高效的纯化转录产物图1. 500bpdsRNA2%琼脂糖凝胶电泳图1:DL2000PlusDNAMarker; 2和4:500bpdsRNA酶解前后产物(双端转);  3和5: 500bpdsRNA酶解前后产物(混合转)。图2.图2. siRNA12%PA
价格:
¥
1350.0
市场价
0.0
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货号:
TR102-01/02
所属分类
体外转录
数量:
-
+
库存:
39996
暂时无货
1
产品详情
FAQ
组分
说明书

T7 RNAi Transcription Kit

用于体外dsRNA 合成

可以转录siRNA和长片段dsRNA;

产量高达20-80 μg;

RNA磁珠可快速高效的纯化转录产物

图1.  500 bp dsRNA 2%琼脂糖凝胶电泳图

1:DL2000 Plus DNA Marker;2和4:500 bp dsRNA酶解前后产物(双端转);3和5:  500 bp dsRNA酶解前后产物(混合转)。

图2.  siRNA 12% PAGE电泳检测结果

1:siRNA转录产物;2:siRNA转录双酶消化产物;3:单链模板;4:双链退火模板

图3. siRNA干扰绿色荧光蛋白表达

左图为GFP质粒与negative control GFP siRNA共转染24 h后的293T细胞;右图为GFP质粒和positive GFP siRNA共转染24 h后的293T细胞。

T7 RNA ploymerase可识别带有T7启动子的DNA模版,以四种NTP 为底物,体外转录合成RNA。T7 RNAi Transcription Kit 是在T7 High Yield RNA Transcription Kit 基础上为转录双链RNA 而设计优化的版本,可用于转录21 bp 的siRNA 和长片段的dsRNA。转录产物经纯化后可用于阳离子脂质体、磷酸钙共沉淀、电穿孔、DEAE- 葡聚糖及显微注射等方法介导的RNAi 实验。一般情况下,一个反应可产生20 μg-80 μg 的RNA。

 

组分

TR102-01(25 rxn)

TR102-02(50 rxn)

Box 1

T7 Enzyme Mix

50 μl

100 μl

10 × Transcription Buffer

50 μl

100 μl

10 × Annealing Buffer

250 μl

500 μl

NTP Mix

200 μl

400 μl

DNase I

25 μl

50 μl

RNase T1(100 U/μl)

25 μl

50 μl

RNase T1 Dilution Buffer

300 μl

600 μl

Control Template*

5 μl

10 μl

Box 2

RNase-free H2O

5 ml

5 ml

RNA Clean Beads

2 ml

4 ml

* 本试剂盒提供的Control Template 为500 bp 双端含T7 启动子的PCR 产物,浓度为0.5 μg/μl。

Box 1 于-20℃保存,Box 2 于4℃保存。

关键词:
T7 RNAi Transcription Kit
体外dsRNA合成
体外转录合成RNA
未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

1. dsRNA 实验方案设计

dsRNA的实验设计有三种方案,

  1. 模板1和模板2分别在两个PCR管中转录后再将产物1:1退火成双链;
  2. 模板1和模板2在同一个PCR管中混合转录后退火成双链;
  3. 用双端带启动子的模板3转录后退火成双链;

一般情况下,方案(1)和(2)的转录产物量更高。若选择方案(1)和(2),模板投入量请按照1:1的比例进行转录,否则产物正义链和负义链RNA的量不相等,退火后会残余较多的单链RNA。

 

2. siRNA 模板链设计

siRNA由于转录模板比较短,所以通常采用化学合成的方式得到四条单链DNA模板, 再两两退火成转录模板。siRNA 3’末端带两个游离的碱基会提高siRNA与mRNA的结合效率,游离碱基为UU时对靶基因的抑制效果最强,若游离碱基为GG则细胞内的RNase会降解这种结构,导致siRNA活性降低。

siRNA 3’端带有两个游离碱基,推荐在设计模板时在模板链3’端加两个A碱基。siRNA 的模板链包含:6个碱基的增强子、20个碱基的T7启动子、19-21个碱基的目标序列及2个游离的T碱基。结构如下所示:

增强子

T7启动子

特定序列

GATCAC

TAATACGACTCACTATAGGG

X19-21TT

 

3. 转录产物产量低

一般情况下,每个反应可以产生20-80 µg 的RNA,如果实验组产量很低,可能原因:

  1. 模板中含有抑制反应的成分;
  2. 模板投入量,模板长度及模板结构均与产量密切相关。 若对照组产量正常但实验组产量低,说明实验模板本身原因导致产量低,请尝试以下方案解决:
  • 纯化模板,并对模板准确定量;
  • 加大模板投入量;
  • 延长37°C 反应时间;
  • 重新设计模板。

4. 短片段模板转录产量低

模板片段小,模板与酶的结合效率会较低,如合成siRNA 比合成其他长度的单双链RNA 产量低。建议适当延长反应时间或增加模板量以提高RNA 产量。

 

5. 产物电泳拖尾现象

电泳过程中有拖尾现象,可能原因是模板投入量较多或者两个模板不以1:1 投入而导致模板或者单链RNA 酶解不彻底,建议适当延长双酶解时间。模板与单链RNA 在总的转录产物中含量极低,一般不会影响后续实验。

6. 转录产物条带不单一

  1. 转录产物存在不同高级结构:建议用变性胶进行电泳,或者RNA经过加热变形后再跑胶;
  2. 转录时产生非特异性产物:如果不影响下游实验可忽略,若担心影响下游实验可切胶回收;
  3. 合成的dsRNA产物不特异:建议使用说明书中转录方案一(模板1和模板2分别在两个PCR管中转录后,定量后再将产物1:1退火成双链);模板浓度不统一,导致转录出的两条链产量不一致;两条链转录效率不一致(属正常现象),有未退火的单链,用试剂盒中提供的酶消化可以消除。

 

7. TR102最长可以合成多长的RNA?

体外转录TR102的长片段dsRNA最长10kb以内。

 

8. 若合成模板的长度为50bp,反应时间建议为多少?

建议时间为4h,产量基本上可以满足需求。一般来说,合成小于0.3 Kb的RNA,可将反应延长至4 h或更长时间,过夜也是可以的,但产量不会多很多

 

9. dsRNA需要进行额外的退火步骤吗?

同一个PCR管中,小于800 bp的转录产物反应后会互补形成dsRNA,大于800 bp需要退火形成dsRNA。两个模板分别在不同的PCR管中转录,则需将反应结束后两个产物混合后进行退火。

 

10. TR102是否可以体外转录单链RNA?

TR102可以做体外转录单链RNA,TR102试剂盒比TR101试剂盒多了2个模块,即:10 x Annealing Buffer、RNase T1(RNase T1特异性降解单链RNA中的G及双链中5’端的3个G游离的碱基),去掉这几个模块,可以参照TR101的说明书操作。

这里使用TR102组份,以说明书TR101中的非修饰RNA体系配制为例:

  1. 反应体系

组份

体积

10 × Transcription Buffer

2 μl

NTP Mix

8μl

DNA模板

x μl

T7 Enzyme Mix

2 μl

RNase-free H2O

up to 20 μl

  1. 后续的步骤均参照说明书操作即可。

 

这是描述信息
Cas9 Nuclease
399.00
399.00
T7 Endonuclease I
579.00
579.00
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