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FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit

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  • cp

    FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit-V21.1.pdf

    大小:
    2021-11-12 17:43:17
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FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit

FastPureEndoFreePlasmidMaxiKit产量高对各种质粒兼容性好内毒素含量极低,后续可做转染级别实验稳定性好图1用FastPureEndofreePlasmidMaxiKit试剂盒提取大小为3.0kb、5.0kb、5.9kb、21.5kb不同大小的质粒,1%琼脂糖胶电泳检测,MDL5000DNAMarker(Vazyme#MD102)。结果显示本试剂盒针对不同大小的质粒均具有较
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798.0
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货号:
DC202-01
所属分类
柱式提取
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-
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产品详情
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组分
说明书

FastPure® EndoFree Plasmid Maxi Kit

质粒大提试剂盒

产量高

兼容不同长度质粒的提取

内毒素含量极低,后续可做转染级别实验

稳定性好

图1

用FastPure® Endofree Plasmid Maxi Kit试剂盒提取大小为3.0 kb、5.0 kb、5.9 kb 、21.5kb不同大小的质粒,1%琼脂糖胶电泳检测,ML:DL15000 DNA Marker(Vazyme #MD103)。结果显示本试剂盒针对不同大小的质粒均具有较好的提取效果,产量高。

图2

使用 FastPure® Endofree Plasmid Maxi Kit 提取的M3K的质粒进行酶切验证,1%琼脂糖胶电泳检测,M:DL5000 DNA Marker (Vazyme # MD102)。结果显示提取的质粒纯度高,对下游酶切反应无抑制作用。

本试剂盒适用于提取150-300ml过夜培养的菌液,采用改进的SDS-碱裂解法裂解菌体,粗提物通过独特的内毒素清除剂,选择性结合离心去除内毒素。独特工艺配方清除内毒素,内毒素含量极低(<0.1 EU/μg DNA),细胞转染效果极佳。提取过程无需使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也无需乙醇沉淀,本试剂盒可快速提取0.2-1.5mg 纯净的高拷贝质粒DNA ,提取率达80-90%。提取质粒可直接用于酶切、PCR、体外转录、转化、测序、等各种分子生物学实验。

组分

DC202-01 (10 rxn)

RNase A

750 μl

Buffer P1

75 ml

Buffer P2

75 ml

Buffer P4

75 ml

内毒素清除剂

25 ml

Buffer PW

2 × 22 ml

Buffer TB

20 ml

FastPure® DNA Maxi Columns(each in a 50 ml Collection Tube)

10 个

RNase A于-30 ~ -15℃保存;

内毒素清除剂可于2 - 8℃保存一个月,长期保存请置于-30 ~ -15℃;

试剂盒其他组分室温(15 ~ 25℃)保存。

关键词:
FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit
质粒大提试剂盒
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Q1:DNA 产量低

A1:(1)质粒拷贝数:

载体因拷贝数差异会造成质高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动,(每毫升培养过夜的菌液,高拷贝数的粒产量明显的波动。质粒载体产量为3-16 μg)。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主,每毫升菌液的产量约为0.5~2 μg;

◇低拷贝质粒:pBR322, pACYC 及其衍生载体,pSC101 及其衍生载体,SuperCos, pWE15;

◇高拷贝质粒:pTZ, pUC, pBS, pGM-T;

(2)大质粒(> 10 kb):

长片段质粒常以中低拷贝数为主,可提升菌液添加量至200 - 300 ml 以提高产量,同时按照比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P4 的用量,洗脱缓冲液Buffer TB 应在55℃ 水浴锅预热,同时在吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率,其他步骤相同;

(3)菌种问题:

菌种保存过程中存在质粒丢失现象,培养细菌前最好先划线活化,以稳定产量;

(4) 细菌未充分裂解:

细菌须在Buffer P1/RNase A 中充分重悬,成团的细菌因无法裂解会降低产量;

(5) 试剂准备有误:

Buffer P2在低温时有沉淀析出,需加热溶解或放置37℃ 恒温箱中至清亮方可使用。Buffer PW 加入乙醇体积不准确(乙醇浓度需控制在80%);

(6)将Elution Buffer 预热至55℃,并重复二次洗脱。

 

Q2:基因组污染

A2:(1) 培养时间太长:

菌液培养时间需控制在12-16 h;

(2)裂解问题:

加入Buffer P2 时,必须轻柔颠倒混匀;处理多个样品时,从加入Buffer P2 时算起,总时间不要超过5 min。

 

Q3:下游结果不理想

A3:(1)盐污染:

确保用Buffer PW2 洗涤两次;

(2)乙醇污染:

在最后一次Buffer PW2 洗涤后可将吸附柱离心时间延长,DC201由原来1 min 增加至2 min,DC202由原来3 min 增加至5 min;

(3)质粒降解:

用endA+ 的菌株如HB101 或其它野生型菌株,含有高丰度的核酸酶,必须加入Buffer PW1;

(4)膜脱落:

在洗脱质粒时硅胶膜在离心过程中可能会发生脱落。10,000 g 离心2 min 后再把质粒转移至新的离心管中;

(5)RNA残留:

① RNase A 可能出现酶活下降:

加入RNase A 的Buffer P1 在4℃ 中放置超过3个月时,可能会出现酶活下降,重新使用时,可在相应的P1 中补充加入10 mg/ml 的RNase A 至终浓度为100 μg/ml;

② Buffer P1 加量较少:

由于菌体悬浮后的浓度过大,导致Buffer P1中RNase A 不足以消化菌体中的RNA。

 

Q4:提取的质粒,进行电泳检测,会出现三条带,分别代表的是什么?

A4:一般来说提取的质粒有三种形态,电泳图从上而下分别是开环DNA、线性DNA和超螺旋DNA。如果提取的质粒污染比较严重,在电泳图上甚至还会看到宿主细胞的基因组和RNA污染。双螺旋质粒的含量是判断质粒提取效果的重要指标,双螺旋质粒的转染效率最高。在实际操作过程中,有时我们只能看到两条带,甚至是一条,可以通过单酶切线性化质粒和原始质粒同时进行电泳,线性化条带所处的位置指示的是质粒的实际大小,而根据相对迁移速度,来判断另一条条带是开环质粒还是超螺旋质粒。

 

Q5:提取质粒的产量?

A5:可快速提取 0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA,提取率达80%-90%。

 

Q6:内毒素清除原理?

A6:内毒素清除剂能与内毒素特异结合,低温时不分层;高温化学键(氢键)断裂,亲水性下降,内毒素清除剂包裹着内毒素形成新的相,通过离心分层达到去除内毒素的效果。

注:核酸几乎不和内毒素清除剂结合。

 

Q7:内毒素清除离心后分层不彻底时,如何改善?

A7:(1)提升离心温度:当室温环境较低时,设置离心机的温度至30℃;

(2)加大离心机转速:由说明书中的12,000×g 提升至14,000×g;

(3)降低离心机降速:修改离心机降速参数至3左右;

(4)增加离心时间:由说明书中的10min增加至15min;

(5)离心后若有少量蓝色物质残留,可以将离心管稍加静置,即蓝色物质会彻底沉降。

 

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