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FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit

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DC202说明书-V22.1.pdf

大小：

2022-08-09 14:42:36

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5085

FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit

高产无内毒，转染级质粒大提

价格：

798.0

市场价

元

798.0

浏览量:

5085

货号：

DC202-01

所属分类

柱式提取

数量：

库存:

9999

*具体价格咨询当地业务员

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产品详情

FAQ

组分

说明书

相关文献

FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit

高产无内毒，转染级质粒大提

质粒DNA提取；产物可用于酶切；PCR；体外转录；连接转化；测序；转染

· 产量高

· 兼容不同长度质粒的提取

· 内毒素含量低，后续可做转染级别实验

· 稳定性好

图1

用FastPureEndofree Plasmid Maxi Kit试剂盒提取大小为3.0 kb、5.0 kb、5.9 kb 、21.5kb不同大小的质粒，1%琼脂糖胶电泳检测，ML：DL15000 DNA Marker（Vazyme #MD103）。结果显示本试剂盒针对不同大小的质粒均具有较好的提取效果，产量高。

图2

使用 FastPureEndofree Plasmid Maxi Kit 提取的M3K的质粒进行酶切验证，1%琼脂糖胶电泳检测，M：DL5000 DNA Marker （Vazyme # MD102）。结果显示提取的质粒纯度高，对下游酶切反应无抑制作用。

本试剂盒采用改进的SDS-碱裂解法裂解菌体，适用于150-300ml过夜培养的菌液，通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心去除内毒素，可快速提取0.2-1.5mg 纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80%-90%。且提取过程无需使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也无需乙醇沉淀。内毒素含量较低（<0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果优异。提取质粒可直接用于酶切、PCR、体外转录、转化、测序、等各种分子生物学实验。

RNase A于-30 ~ -15℃保存；

内毒素清除剂可于2 - 8℃保存一个月，长期保存请置于-30 ~ -15℃；

试剂盒其他组分室温(15 ~ 25℃)保存。

关键词:

DC202

质粒DNA提取

无内毒素质粒大提

质粒分离

质粒抽提

质粒提取

质粒DNA大提

无内毒素质粒提取

质粒大提

质粒DNA

去内毒素质粒提取

质粒纯化

质粒DNA纯化

质粒大量纯化

质粒DNA大量纯化

DNA提取

Q1：DNA 产量低

A1：（1）质粒拷贝数：

载体因拷贝数差异会造成质高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动，(每毫升培养过夜的菌液，高拷贝数的粒产量明显的波动。质粒载体产量为3-16 μg)。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5~2 μg；

◇低拷贝质粒：pBR322, pACYC 及其衍生载体，pSC101 及其衍生载体，SuperCos, pWE15；

◇高拷贝质粒：pTZ, pUC, pBS, pGM-T；

（2）大质粒(> 10 kb)：

长片段质粒常以中低拷贝数为主，可提升菌液添加量至200 - 300 ml 以提高产量，同时按照比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P4 的用量，洗脱缓冲液Buffer TB 应在55℃ 水浴锅预热，同时在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率，其他步骤相同；

（3）菌种问题：

菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好先划线活化，以稳定产量；

（4）细菌未充分裂解：

细菌须在Buffer P1/RNase A 中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量；

（5）试剂准备有误：

Buffer P2在低温时有沉淀析出，需加热溶解或放置37℃ 恒温箱中至清亮方可使用。Buffer PW 加入乙醇体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)；

（6）将Elution Buffer 预热至55℃，并重复二次洗脱。

Q2：基因组污染

A2：(1) 培养时间太长：

菌液培养时间需控制在12-16 h；

(2)裂解问题：

加入Buffer P2 时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，从加入Buffer P2 时算起，总时间不要超过5 min。

Q3：下游结果不理想

A3：（1）盐污染：

确保用Buffer PW2 洗涤两次；

（2）乙醇污染：

在最后一次Buffer PW2 洗涤后可将吸附柱离心时间延长，DC201由原来1 min 增加至2 min，DC202由原来3 min 增加至5 min；

（3）质粒降解：

用endA+ 的菌株如HB101 或其它野生型菌株，含有高丰度的核酸酶，必须加入Buffer PW1；

（4）膜脱落：

在洗脱质粒时硅胶膜在离心过程中可能会发生脱落。10,000 g 离心2 min 后再把质粒转移至新的离心管中；

（5）RNA残留：

① RNase A 可能出现酶活下降：

加入RNase A 的Buffer P1 在4℃ 中放置超过3个月时，可能会出现酶活下降，重新使用时，可在相应的P1 中补充加入10 mg/ml 的RNase A 至终浓度为100 μg/ml；

② Buffer P1 加量较少：

由于菌体悬浮后的浓度过大，导致Buffer P1中RNase A 不足以消化菌体中的RNA。

Q4：提取的质粒，进行电泳检测，会出现三条带，分别代表的是什么？

A4：一般来说提取的质粒有三种形态，电泳图从上而下分别是开环DNA、线性DNA和超螺旋DNA。如果提取的质粒污染比较严重，在电泳图上甚至还会看到宿主细胞的基因组和RNA污染。双螺旋质粒的含量是判断质粒提取效果的重要指标，双螺旋质粒的转染效率最高。在实际操作过程中，有时我们只能看到两条带，甚至是一条，可以通过单酶切线性化质粒和原始质粒同时进行电泳，线性化条带所处的位置指示的是质粒的实际大小，而根据相对迁移速度，来判断另一条条带是开环质粒还是超螺旋质粒。

Q5：提取质粒的产量？

A5：可快速提取 0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80%-90%。

Q6：内毒素清除原理？

A6：内毒素清除剂能与内毒素特异结合，低温时不分层；高温化学键（氢键）断裂，亲水性下降，内毒素清除剂包裹着内毒素形成新的相，通过离心分层达到去除内毒素的效果。

注：核酸几乎不和内毒素清除剂结合。

Q7：内毒素清除离心后分层不彻底时，如何改善？

A7：（1）提升离心温度：当室温环境较低时，设置离心机的温度至30℃；

（2）加大离心机转速：由说明书中的12,000×g 提升至14,000×g；

（3）降低离心机降速：修改离心机降速参数至3左右；

（4）增加离心时间：由说明书中的10min增加至15min；

（5）离心后若有少量蓝色物质残留，可以将离心管稍加静置，即蓝色物质会彻底沉降。