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Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep...-V22.1.pdf
大小：2022-03-03 17:38:50
Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina
Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina
蛋白质-DNA互作
· 操作简单：可一步实现DNA的片段化和接头连接，仅需9 h即可实现从细胞到二代测序文库的转化
· 高活性：兼具Protein G&Tn5活性，DNA片段化活性较高
· 细胞起始量低：可兼容低至60个细胞，甚至单细胞
· 纯度高：蛋白纯度高、核酸残留低
1. CUT&Tag技术原理及应用
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是替换传统的ChIP-Seq用以研究蛋白质-基因组互作的新技术，与后者相比，它具有显著优势，如：信噪比高，可重复性好，实验周期短（1天实现从细胞到文库构建），细胞投入量低等，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。
CUT&Tag技术的实验流程简单，主要包括：①收集细胞；②分别孵育一抗和二抗；③孵育pA/pG-Tn5转座子（Hyperactive pA/pG-Tn5 Transposon）；④激活转座子，进行DNA片段化；⑤DNA提取；⑥文库扩增与纯化。
2. 转座子切割活性高
如图所示，对Vazyme #TD901中提供的pG-Tn5转座子进行活性检测，投入50 ng 人基因组DNA（gDNA），1 μl转座子可快速（10 min）实现DNA片段化，说明该融合酶切割DNA活性高。
3. 细胞起始量低
A: CUT&Tag峰形图
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100 cells
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10,000 cells
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如图A所示：投入不同起始量的HEK293细胞（100或10,000个细胞），按照Vazyme #TD901说明书推荐的反应体系进行CUT&Tag实验；其中，pG-Tn5转座子使用的终浓度为0.04 μM，一抗为H3K27me3（CST，#9733），二抗为Goat anti Rabbit（Bioworld，#BS13271）。通过使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行文库分布检测，结果显示对于不同细胞投入量（100个或10,000个细胞），均可构建出与文献中类似的呈现Ladder状的文库，说明该体系能够兼容低细胞起始量的实验。
B：Peak 富集
如图B所示：将图A中的CUT&Tag文库进行二代测序分析，可以看出，100个细胞可以达到与10,000细胞类似的Peak富集，且信噪比显著高于ChIP-Seq。
4. 实验重复性好
如上图所示，投入不同起始量（1,000、10,000或100,000）的HEK293细胞，每种起始量做2个重复，按照Vazyme #TD901说明书推荐的反应体系进行CUT&Tag实验；其中，pG-Tn5转座子使用的终浓度为0.04 μM，一抗为H3K27me3（CST，#9733），二抗为Goat anti Rabbit（Bioworld，#BS13271），阴性对照为与一抗同源的IgG（CST，#2729）。对上述文库样本进行二代测序，针对富集的reads进行pearson相关性分析，可以看出，平行样本之间的重复性较好。
Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina是针对CUT&Tag技术定向开发的专用试剂盒。CUT&Tag技术是一种研究蛋白质-DNA互作的新方法，通过将Protein G或Protein A与经过工程学改造的高活性Tn5转座酶融合，形成兼具双重活性的新型融合酶(Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 Transposase)，在抗体引导下精准靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。与传统的ChIP-Seq相比，该技术具有细胞投入量低、实验周期短、信噪比高、可重复性好等优势，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。试剂盒中所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，较大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
BOX 1：ConA beads 2 ~ 8℃保存，其余组分室温储存。
BOX 2：5% Digitonin -30 ~ -15℃保存，室温下可保存1周；
10 × Binding Buffer -30 ~ -15℃保存，2 ~ 8℃下可保存6个月；
其余组分-30 ~ -15℃储存。
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