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HiScript-TS 5'/3' RACE Kit

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RA101说明书-V21.2.pdf

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2022-08-04 08:51:20

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RACE序列比对软件使用说明书.pdf

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2022-08-05 10:17:28

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1000

HiScript-TS 5'/3' RACE Kit

5'/3'RACE 扩增试剂盒

价格：

5000.0

市场价

元

5000.0

浏览量:

1000

货号：

RA101-01

所属分类

5’RACE & 3’RACE扩增

数量：

库存:

999

*具体价格咨询当地业务员

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说明书

相关文献

HiScript-TS 5'/3' RACE Kit

5'/3'RACE 扩增试剂盒

5'/3' RACE扩增；cDNA末端的快速扩增

· 优异的逆转录性能：逆转长度高达15 kb，识别丰度低至0.9 RPK

· 高效的 cDNA 扩增性能：PCR 模块可兼容 GC 含量范围为 36-70% 的转录本

· 实验便捷：配套的RACE 引物设计软件和测序比对软件

HiScript-TS 5’/3’ RACE Kit 以 RNA 为模板高效逆转全长 cDNA，并以 cDNA 为模板快速扩增其 5’末端或 3’末端。试剂盒提供定向改造的具有 Template-Switching 活性的逆转录酶和高保真 PCR 扩增 Mix，无需进行接头连接。其中逆转录模块可逆转长度高达 15 kb 的转录本，识别丰度低至 0.9 RPKM(Reads Per Kilobase Per Million Reads) 的转录本；PCR 模块可兼容 GC 含量范围为 36-70% 的转录本。优异的逆转录性能与 cDNA 扩增性能提高了 RACE 成功率。产品 Mix 形式简化了加样流程，使操作更为简便快捷。同时配套RACE 引物设计软件和测序比对软件，使 RACE 实验变得不再复杂。

1. 优异的逆转录性能

以1 µg 293细胞 Total RNA为模板，使用HiScript-TS5'/3' RACE Kit(Vazyme #RA101)测试已知全长序列的不同丰度／不同长度的mRNA转录本，将获得的5'RACE扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

由图 1可以看出，不同对于丰度 / 不同长度的转录本，5' RACE 扩增均可得到清晰的正确条带（红色箭头指示），说明 Vazyme #RA101逆转录模块性能优异，可以兼容丰度范围为0.9-574.3RPKM、长度范围为 1.5- 15.2 kb的转录本。

图1．不同丰度/不同长度转录本5'RACE产物

2. 高效的cDNA扩增性能

以1µg 293细胞Total RNA为模板，使用HiScript-TS5'/3'RACE Kit(Vazyme #RA101)测试已知全长序列的不同GC含量的转录本，逆转录后进行5'RACE PCR扩增，将获得的5'RACE扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

由图 2 可以看出，PCR扩增得到清晰的正确条带（红色箭头指示），说明Vazyme #RA101 PCR扩增模块可以成功扩增GC含昼为36- 70%的片段。

图2．不同扩增长度/ GC含量5'RACE产物

Box 1， -80 ~ -65°C保存，干冰运输；

Box 2， -30 ~ -15°C保存，干冰运输。

关键词:

RA101

5'RACE扩增

3'RACE扩增

RACE扩增

快速扩增cDNA末端

RACE

cDNA末端扩增

5'末端扩增

3'末端扩增

高效 cDNA 扩增

逆转录

反转录

RT-PCR

Q1：试剂盒中3’和5’ Control GSP扩增出来的长度是多长？

A1：3’ 长1380bp，5’ 579bp。

Q2：无扩增产物或者产物弥散

A2：（1）RNA提取物中无目的转录本：可以设计已知转录本区域的qPCR或PCR引物进行目的产物检测；

（2）RNA降解：进行试验前检测RNA的完整度，可以通过RNA琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整度，也可以使用Agilent RNA 6000 Pico Kit 评价RNA完整度；

（3）目的转录本表达丰度低：通过qPCR或者PCR结果判定基因表达丰度。若检测后发现表达丰度低，可以增加RNA模板投入量（不超过4 μg）；增加cDNA的投入量，减少cDNA稀释倍数（50 μl PCR反应体系，未稀释cDNA投入量不超过10 μl）；

（4）设计Nested GSP，进行多轮巢式PCR，富集产物片段同时保证了扩增产物特异性；

（5）待扩增目的片段过长：GSP设计尽可能放在已知序列末端。若扩增片段≤3Kb，延伸时间为3min，若扩增片段>3Kb，产物每增加1kb，延伸时间提高30sec；

（6）设计GSP引物Tm过低：设计GSP Tm≥65℃，若Tm≥70℃，使用降落PCR有利于提高产物特异性。

Q3：PCR产生复杂带型

A3：（1）目的基因属于多基因家族，可以进行数据库对比，针对特异性区段序列设计GSP；

（2）可能是RNA前体具有可变剪接形式，可以进行数据库对比，针对特异性区段序列设计GSP；

（3）扩增非特异性：设计额外的NGSP，进行多轮巢式PCR（不超过三次），将目的产物进行切胶回收，再次进行PCR扩增。

建议：跑胶出来的条带，可全部回收，克隆测序。

Q4：PCR产生的条带较弱

A4:（1）模板量过少，建议投入cDNA原液；

（2）引物扩增效率差，建议重新设计引物或者进行多轮巢式PCR（不超过三轮）（3）目的转录本表达丰度低：通过qPCR或者PCR结果判定基因表达丰度。若检测后发现表达丰度低，可以增加RNA模板投入量（不超过4μg）；增加cDNA的投入量，减少cDNA稀释倍数（50μl PCR反应体系，未稀释cDNA投入量不超过10μl）；

Q5：无 poly A+ RNA的如何进行3‘RACE或5’RACE？

A5：5‘端RACE可使用5’Random Primer进行一链cDNA合成（试剂盒中提供）；或使用GSP进行一链cDNA合成，建议下一步PCR扩增时，使用巢式GSP进行扩增，特异性和阳性率会提高。

3‘端，可通过Poly Polymerase进行加A处理后进行试验，或通过其他3’末端转移酶进行寡聚加A尾处理后进行实验。

Q6：逆转录时，针对没有帽子结构的RNA，cDNA是否能加上接头？

A6：可以的。无5’帽子结构，逆转录酶可以在模板末端加上特定碱基与接头配对。如果有5’帽子结构的加接头效率更高。同理降解RNA末端也可以加上。

但当遇到RNA复杂结构而导致逆转录酶掉下模板的情况下，cDNA末端无法添加特定碱基。

Q7：基因组残留会影响实验结果吗？

A7：如果基因组残留<20%RNA投入量，影响不明显，如果大于20%，会对cDNA扩增产生抑制，建议重新制备RNA。