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    Dual Luciferase Reporter Assay Kit-V10.2.pdf

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    2021-08-27 15:44:14
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Dual Luciferase Reporter Assay Kit

DualLuciferaseReporterAssayKit双萤光检测、结果更可靠萤光信号强检测范围宽灵敏度高分别构建Fireflyluciferase表达载体及Renillaluciferase表达载体,共同转染HEK293T细胞。使用不同公司试剂盒裂解细胞并检测Luciferin及Coelenterazine萤光强度。结果显示: Vazyme的双萤光素酶检测试剂盒中两种底物的萤光强度与P公司一
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Dual Luciferase Reporter Assay Kit

双萤光检测、结果更可靠

萤光信号强

检测范围宽

灵敏度高

分别构建Firefly luciferase 表达载体及Renilla luciferase 表达载体,共同转染HEK293T 细胞。使用不同公司试剂盒裂解细胞并检测Luciferin 及Coelenterazine 萤光强度。结果显示: Vazyme 的双萤光素酶检测试剂盒中两种底物的萤光强度与P 公司一致,均显著高于T/B/Y 公司同款产品。

使用10-11~10-18 mol Luciferase(Sigma# L9506) 作为检测底物,使用V的1*细胞裂解液溶解后梯度稀释到10-11~10-18 mol 并检测Luciferin荧光强度。线性关系达到8个数量级(R2>0.99),检测下限达到10-18 mol/assay。

Dual Luciferase Reporter Assay Kit 用于检测报告质粒转染细胞后Luciferin 底物萤光强度,从而反映萤光素酶的表达量,达到检测基因调控的目的。首先以萤光素(Luciferin)为底物检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase),后以腔肠素为底物检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase), 实现双萤光素酶报告基因检测。双萤光素酶检测试剂盒通过检测萤火虫萤光素酶活性,评价调控元件受刺激物诱导的作用强弱;Renilla luciferase 作为校正转染效率的内参,消除孔间细胞数量和转染效率的差异, 确保结果可靠。

组分 DL101-01 100 rxn(100μL/rxn)
5×Cell Lysis Buffer 10 ml
Reaction BufferⅡ(Luciferase) 10 ml
Luciferase Substrate(Lyophilized) 1 vial
Stop & Reaction Buffer 10 ml
Renilla Substrate 200 μL

-20℃保存;溶解分装后的Luciferase Substrate 可于-80℃长期保存,或-20℃短期保存不超过1个月

关键词:
DualLuciferaseReporterAssayKit
双萤光检测
DL101-01
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Q1:双萤光素酶操作注意事项

A1:(1)先设置酶标仪程序,到放入酶标板就可以测定的程度,再开始加样。程序设置选择“化学发光/luminscence/LUM/全波长,不要选择某一波长检测。

(2)加样用排枪,加样时间最好不要超过90 s。裂解液或者Luciferase底物可以预先放入酶标板中,设置好程序后用排枪加另外一种。

(3)Renlia底物是溶于无水乙醇的,极易挥发,如发现液体体积有明显减少,请加入无水乙醇补足体积后保存,即用即盖,计算用量。Renlia与Stop & Reaction buffer现用现配,不要预混。

(4)试剂使用完后注意保存条件,luciferase底物分装后放在-80℃,Renlia放在-20℃。

 

Q2:荧光值低

A2:(1)转染效率与表达效率:

  • 细胞用量低或转染效率低:建议做预实验优化转染条件,如:增加细胞用量,优化转染试剂的用量、DNA/RNA用量和比例、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间,建议在质粒上加GFP作为转染效率验证。
  • 质粒表达量低:可以适当减少裂解液用量来提高蛋白浓度,同时设置多个复孔,减少因低浓度造成的孔间差异。

(2)加样速度/即加即检:DL101是闪光型检测试剂,如果不立即测定,荧光容易淬灭,所以推荐排枪加样,加完立即检测。建议提前设置好检测程序(化学发光/luminescence/全波长)

(3)试剂存放:打开使用后,Luciferase分装好避光保存在-80℃,Renilla底物要求放在-20℃,且Renlia底物预先溶解于乙醇中,存放过程需要注意是否存在乙醇挥发的问题。

(4)反应体系要求:反应体系要求细胞裂解液:底物=1:5,如果想要减少底物用量,那么需要对应的减少裂解液用量以平衡反应体系。

 

Q3:细胞密度较大,裂解不完全,裂解后没办法剥离细胞怎么办?

A3:(1)放在37度裂解,并延长裂解时间,但是也不能裂解太过,能剥离下来就可以;

       (2)降低转染时的细胞密度。防止细胞太多,超出裂解液兼容范围,导致裂解不充分的情况发生;

 

Q4:luciferase和Renilla转染的比例应该是多少,分别转染多少ng?

A4:luciferase和Renilla转染的比例一般为10:1,luciferase转染量根据转染试剂说明书和相关文献确定,可以做预实验根据实验具体情况调整比例,预实验建议海肾载体与萤火虫载体比例分别用1:10、1:20、1:50、1:100,萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

 

Q5:复孔之间差异大

A5:(1)实验平行复孔(不同细胞孔):不同孔之间的数值影响因素太多,建议在铺板时尽量把同一批培养的细胞均匀的分布到每一个孔中,同一实验组转染时尽量做mix,避免单孔加样。

       (2)来源于同一个细胞孔的裂解液复孔:注意实验操作,加样顺序和速度,加样量。检查排枪加样是否存在不均一问题。

 

Q6:不同次实验结果差异大

A6:(1)不同次实验中的细胞状态,细胞密度,和实验操作之间都有可能有些许差异,尽量选择同一批次或者相近批次的细胞进行实验,如果最终结果荧光素酶活性相对的趋势是一致的,则没有问题。

       (2)在此期间试剂存放是否有问题。

 

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