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高敏型ECL化学发光检测试剂盒（即用型）

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    高敏型ECL 化学发光检测试剂盒-V21.1.pdf

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    2021-04-09 16:31:29
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高敏型ECL化学发光检测试剂盒（即用型）

灵敏，锁定你的目的蛋白
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货号：
E412-01/02
所属分类
Western Blot
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高敏型ECL化学发光检测试剂盒（即用型）

灵敏，锁定你的目的蛋白

抗原及抗体检测

·高质量的western显影试剂：具有较高的灵敏度和高信噪比，显影条带平直均一。
·优化的配方：增强发光强度
·抗淬灭能力强：荧光持续时间久至数小时。
·兼容胶片曝光和CCD扫描：显影定影后条带可清晰显示在X光胶片上，也可直接对印迹膜进行CCD扫描。

图1. 不同品牌的ECL试剂进行Western检测结果

本实验设置了4个不同浓度梯度的蛋白质，Vazyme的高敏型ECL化学发光试剂的检测灵敏度、发光强度、持久性均显著优于竞品试剂。

图2. 不同品牌的ECL试剂进行Western检测结果

 

由于T公司和B公司的试剂检测灵敏度比较低，本实验设置了3个不同浓度梯度的蛋白质，Vazyme的高敏型ECL化学发光试剂的检测灵敏度、发光强度、持久性均显著优于竞品试剂，而且B公司超敏试剂的背景值很高，影响观察结果。

本试剂盒以化学发光方法检测蛋白质或核酸类生物大分子。蛋白质或核酸类生物大分子在电泳后转移到印迹膜上，分别用一抗和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP) 标记的二抗顺序结合膜上的目的蛋白；或以HRP 标记的探针直接或间接结合膜上的目的核酸。洗膜后用新鲜配制的ECL 工作液，在室温下避光孵育膜2 min-3 min，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X 光片曝光暗盒，然后转入暗室将X 光胶片压在膜上曝光时长可为数秒到数小时。显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰显示在X 光胶片上，也可不进行X光胶片曝光显影步骤，直接对印迹膜进行CCD 扫描。本试剂盒采用了独特的发光底物系统，有效降低曝光背景、提高检测灵敏度，并在检测持久性和信噪比方面与ECL 增强型发光试剂盒(Vazyme #E411) 相比有显著改善。

2-8℃避光保存。如果长期不用，可以-20℃避光保存。

关键词:
E412
ECL；化学发光检测；高敏型ECL化学发光检测；发光液；蛋白显影液；高敏型显影液；Western Blot；显影液；发光液；ECL化学发光检测；ECL发光液；ECL显影液；Western Blot；蛋白分析；蛋白检测
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Q1：膜上没有信号的原因有哪些？

A1：（1）没有Marker或条带很弱可能是转膜过程出现失误，建议更换缓冲液、排查正负电极是否插反，转膜“三明治”顺序是否正确；

（2）Marker正常：

  • 细胞中不表达目的蛋白，尝试换一种细胞；
  • 细胞中的蛋白质被降解掉了，必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，并且提取过程冰上操作；
  • 抗体或酶失活，选择在有效期内的试剂；
  • 抗体不能识别目的蛋白，确认该抗体是否适用于Western；
  • 发光液与二抗标记不匹配（如AP标记不能用ECL发光液）。

 

Q2：目的带很弱

A2：（1）标本中靶蛋白含量低，可以加大样品的上样量；

（2）转膜不充分，可以提高转膜电流或延长转膜时间；

（3）抗体效价低，可以减少抗体的稀释倍数，增加抗体浓度。

 

Q3：胶片背景很脏，有什么解决方法？

A3：（1）膜没有均匀浸湿，PVDF膜转膜前应该用100%甲醇将膜完全浸湿10秒，快速激活；

（2）膜或者缓冲液污染，拿取膜与吸水纸时要戴手套，及时更换新鲜转膜缓冲液；

（3）封闭不彻底： 延长封闭时间，4度过夜封闭可以降低背景；增加封闭蛋白浓度；更换封闭液，如BSA或Superblock；

（4）抗体与封闭剂出现交叉反应，检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应；

（5）抗体浓度过高，增加抗体稀释倍数；

（6）洗膜不彻底：少量多次洗涤；适当增加去垢剂强度，如Tween-20换成NP-40；

（7）蛋白上样量太高：减少蛋白上样量或者增加抗体稀释倍数。

 

Q4：条带过粗或过曝光

A4：（1）减少蛋白上样量；

（2）调整曝光时间；

（3）减少发光液孵育时间及用量（保证覆盖整张膜），如果过曝可以用缓冲液适当洗涤后重新显色并调整显色的时间。

 

Q5：ECL使用注意事项。

A5：（1）ECL工作液配制过程中吸取ECL Substrate A 液和Peroxide Solution B液时务必更换吸头，工作液新鲜配制后应立即使用，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低；

（2）Peroxide Solution B液含有氧化剂，易被还原而失效。各溶液使用后，请盖紧瓶盖，以防失效；

（3）ECL发光液是HRP的显色底物，因此检测系统最终必须基于HRP酶标记抗体或者核酸探针；

（4）尽量避免将多张膜置于同一个洗膜盒内洗膜，相互吸附或摩擦可能造成背景增加；

（5）应使用高质量保鲜膜。质量较差的保鲜膜可能会淬灭荧光或由于含有杂质而污染印迹膜造成曝光背景值偏高；

（6）根据目的蛋白丰度不同，曝光时间可能是数秒至数小时。曝光时间不足会导致目的条带不明确，曝光时间过长会使背景加深；

（7）叠氮化钠（NaN3）能抑制HRP活性，若回收HRP标记探针或者抗体应避免使用NaN3，如必需使用勿超过0.01%； 

（8）由于发光液灵敏，推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗1:1000-1:4000，二抗1:2000-1:5000。抗体浓度过高可能造成高背景或没有条带；

（9）ECL Substrate A液和Peroxide Solution B液均对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

Q6：ECL能否不压胶直接照。

A6：如果使用凝胶成像仪，可以直接照。

 

Q7：ECL工作液怎么配置？双蒸水可以用ddH2O代替么？有试用装么？可以不用X光片吗？

A7：(1) 新鲜配制ECL工作液：Buffer A和Buffer B按1:1混合后，用双蒸水10倍稀释，即为ECL工作液。须立即使用；

(2) 双蒸水：两次蒸馏冷凝的水；ddH2O：就是二次蒸馏水；

(3) 没有试用装；

(4) 建议按说明书要求，直接放到仪器里面曝光也是可以的（把western的膜有蛋白的那面朝上，放在拍照的仪器里面，然后把A液B液等体积混匀，滴加在膜上，使溶液覆盖整个膜，拍照）。

 

Chen Y, Xu X, Wang L, et al. Genetic insights into therapeutic targets for aortic aneurysms: A Mendelian randomization study. EBioMedicine. 2022, 83: 104199. PMID:35952493 (IF:11.205)

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BCA Protein Quantification Kit
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Detergent Compatible Bradford Protein Quantification Kit
680.00
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180 kDa Prestained Protein Marker
510.00
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