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产品分类
  • C602-pCE3 Blunt-Zero Vector.dna

    大小:
    2022-07-01 14:00:32
  • cp

    C602说明书-V22.2.pdf

    大小:
    2022-07-20 09:49:11
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1000

5 min TOPO-Blunt Cloning Kit

5 min TOPO-Blunt Cloning Kit 高阳性率 反应快速 连接片段更长 5 min TOPO-Blunt Cloning Kit采用第三代Topoisomerase,配合合适的Buffer,活性更高,搭配自连抑制因子,提高克隆阳性率,5 min 完成高效连接。C602适用于平末端连接。 连接片段更长,高阳性率 将1kb、3kb、7kb回收后的片段使用C602 25℃连接5 min,进行转化涂板后,挑取单克隆进行菌落PCR验证。如图1,1kb、3kb、7kb片段的阳性率均为100%。 图1:1kb、3kb、7kb三个片段连接后的阳性率鉴定 -30~ -15℃ 保存
价格:
¥
750.0
市场价
0.0
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货号:
C602-01/02
所属分类
拓扑克隆
数量:
-
+
库存:
1998
*具体价格咨询当地业务员
暂时无货
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组分
说明书

5 min TOPO-Blunt Cloning Kit

高阳性率

反应快速

连接片段更长

5 min TOPO-Blunt Cloning Kit采用第三代Topoisomerase,配合合适的Buffer,活性更高,搭配自连抑制因子,提高克隆阳性率,5 min 完成高效连接。C602适用于平末端连接。

连接片段更长,高阳性率

将1kb、3kb、7kb回收后的片段使用C602 25℃连接5 min,进行转化涂板后,挑取单克隆进行菌落PCR验证。如图1,1kb、3kb、7kb片段的阳性率均为100%。

图1:1kb、3kb、7kb三个片段连接后的阳性率鉴定

-30~ -15℃ 保存

关键词:
阳性率
连接
片段
min
topo-blunt
primer
3kb
7kb
m13
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Q1:平板上长不出克隆/克隆很少/空载体

A1:插入片段必须为平末端PCR产物,5’端不能为磷酸化(不能是酶切产物)

A2:平板抗性为氨苄霉素

A3:如果插入片段回收浓度较低(<20 ng/µl),需要重新制备插入片段,多管浓缩,以提升插入片段浓度;若插入片段回收浓度过高,需将其稀释以保证添加其体积数≥1 µl

A4:按照说明书推荐公式对插入片段投入量进行计算,避免小体积(<1 µl)加入体系中,当计算投入量<5 ng时,按5 ng投入

A5:反应最好在PCR仪中进行,合适连接温度是25℃

 

Q2:菌液PCR无目的条带

A1:只有空质粒的条带,说明重组不成功,按照Q1排查提高连接效率。

A2:PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带,建议优化PCR体系,程序;或者提取质粒,以质粒为模板进行PCR验证;或者进行酶切验证

A3:PCR试剂不合适:试剂不适合菌液直扩,或者扩增片段太长,超出了试剂的使用范围

 

Q3:多数克隆含有不正确的插入片段

A1:PCR产物混有非特异性产物:优化PCR体系,提高特异性;胶回收PCR产物;鉴定更多的克隆

A2:反应体系中混入了相同抗性的质粒:PCR扩增模板为环状质粒时,如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnⅠ消化,或者直接进行胶回收纯化

 

Q4:插入片段出现碱基突变

A1:只测试了一个样本,不一定可信,需要多测几个样本

A2:检查突变处的测序信号是否有问题,若为双峰或者杂峰不一定可信

A3:如果多个结果突变位点一致,可能是从模板上引入的或者模板序列与NCBI上的不一致

A4:制备插入片段时推荐使用高保真聚合酶

A5:若引物处发生碱基突变,可能是引物合成问题,建议重新合成引物进行实验

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