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Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR

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HD101产品说明书-V22.1.pdf

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2023-01-30 16:24:19

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Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR

快速高效靶向切割目的片段，无需建库即可实现基因定量

价格：

6800.0

市场价

元

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货号：

HD101-01/02

所属分类

核酸蛋白互作

数量：

库存:

1998

*具体价格咨询当地业务员

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产品详情

FAQ

组分

说明书

相关文献

Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR

快速高效靶向切割目的片段，无需建库即可实现基因定量。

蛋白质-DNA互作

· 操作体验好：实验流程简单，包含DNA提取模块，告别酚氯仿抽提。

· 产品性能好：转录因子、辅因子成功率高，产出更稳定，结果更真实。

· 结果更准确：含有Spike in DNA组分，校正组间差异。

· 区分下游实验：无需建库，可直接进行qPCR，满足不同实验需求。

Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR是用于研究蛋白质-DNA相互作用的试剂盒。CUT&RUN（Cleavage Under Target and Release Using Nuclease）技术是一种研究蛋白质-DNA相互作用的新方法，使用Protein G融合的MNase核酸酶，在抗体引导下精准靶向目的蛋白，并在目的位点附近进行DNA的片段化切割。本试剂盒优化了实验反应体系和操作流程，与传统的ChIP-qPCR相比，具有检测成功率高、抗体兼容性强、实验周期短、操作简单等优势，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。试剂盒中所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，较大程度上保证了实验结果的稳定性和重复性。

1. 目的蛋白兼容性

以10,000和100,000个239细胞为样本，在不同靶蛋白体系中，针对不同的目的基因富集片段设计qPCR引物，均可以成功进行qPCR扩增。结果表明HD101可兼容不同类型、不同丰度的靶蛋白，目的基因片段富集效果好。

图1 293细胞中H3K4me3、H3K27me3、CTCF、Ezh2互作DNA的富集程度

2. 细胞类型兼容性测试

在293、Hela、K562三种不同细胞类型中，针对组蛋白H3K4me3和转录因子CTCF设计目的基因qPCR引物，可以成功富集目的片段，并进行qPCR扩增，结果表明HD101在不同的细胞类型中发挥稳定。

图2 不同类型细胞中H3K4me3、CTCF互作DNA的富集程度

3. 细胞投入量兼容性测试

投入5,000、10,000、100,000、500,000个293细胞，针对组蛋白H3K4me3和转录因子CTCF设计目的基因qPCR引物，可以成功富集目的片段，并进行qPCR扩增，结果表明HD101在不同的细胞投入量下发挥稳定。

图3 不同细胞投入量下H3K4me3、CTCF互作DNA的富集程度

4. Spike in DNA校准测试

通过梯度投入Spike in DNA（1 pg / 10,000 cells）对不同细胞投入量测得的C_T值进行均一化校正，校正后的C_T值差值小于1，目的基因富集程度趋于一致。因此，HD101提供的Spike in DNA可实现样本间的均一化校准。

图4 Spike in DNA校正前后C_T值的比较

BOX1：2 ~ 8 ℃保存，根据不同目的地调整运输方式；

BOX2：15 ~ 25 ℃保存，常温运输；

BOX3：-30 ~ -15 ℃保存，≤0℃运输。

关键词:

HD101

CUT&RUN文库构建

pG-MNase酶

CUT&RUN检测

CUT&RUN qPCR

CUT&RUN定量试盒

CUT&RUN试剂

蛋白质-DNA互作

核酸蛋白互作

靶向切割目的片段

1. CUT&RUN适用于什么物种?

CUT&RUN Protocol广泛适用于常规哺乳动物细胞的蛋白质-DNA互作研究，酵母、植物等细胞需要经过特殊的处理后进行实验，但是细胞投入量不宜过低，较低细胞投入量下实验结果较差。

2. ConA磁珠主要作用是什么?

ConA磁珠经过刀豆蛋白A包被，能与细胞膜上的糖蛋白结合，从而吸附细胞，使细胞处理操作可视化，以减少在后续实验过程中细胞的损失。

3. CUT&RUN能否使用二抗？

进行CUT&RUN实验时通常不需要二抗，当使用亲和力较低的一抗，或靶蛋白丰度较低时，可以考虑二抗。但必须要说的是，MNase的切割活性很强，我们在CUT&RUN整个实验流程做出的努力是为了限制MNase的活性，较大程度避免非特异性切割，加入二抗会增加非特异性切割的概率，导致背景偏高，因此请慎重选择是否使用二抗。

4. CUT&RUN 对常/异染色质的切割是否存在偏好性？

否，CUT&RUN对常染色质或异染色质无任何偏向性。在CUT&RUN中，无论是常染色质还是异染色质，靶蛋白特异性抗体募集 pG-MNase，并将切割引导至与该抗体直接相邻的染色质。在这种情况下，即使在较难接近的异染色质中，pG-MNase也能与染色质产生有效束缚并发生切割。

5. qPCR熔解曲线出现多峰的原因？

引物设计不优，推荐qPCR引物扩增长度在100 - 200 bp之间，按照引物设计原则进行设计。

6. CUT&RUN实验时需要做阳性对照和阴性对照吗？

根据实际需求判断是否需要阳性对照和阴性对照。一般来说，阳性对照是为了排除实验环境不佳、实验操作不当、样本处理不合格等因素，通常选择丰度较高的组蛋白（如H3K4me3）或转录因子（如CTCF）作为阳性对照，阳性对照不是必需的。阴性对照的作用主要是排除非特异性切割，通常选择IgG或不加一抗作为阴性对照。

7. 在高低丰度组蛋白及转录因子体系中，CUT&RUN-qPCR的测试结果？

以100,000 293细胞为样本，分别对兴奋性组蛋白体系H3K4me3、抑制性组蛋白体系H3K27me3、转录因子体系CTCF和RNA pol II进行CUT&RUN-qPCR实验，结果如下图所示。

图1 不同体系的CUT&RUN-qPCR结果

HD101可以兼容高中低丰度组蛋白以及转录因子体系，可以兼容抑制性组蛋白修饰靶点，低丰度体系为了获得更好的qPCR结果，建议尝试设计多对特异性高且丰度相对较高的qPCR扩增靶点，推荐qPCR引物扩增长度在100 - 200 bp左右，按照引物设计原则进行设计。当IgG CT值与特异性靶点CT值相差较小时，可以通过缩短pG-MNase消化时间、增加细胞投入量以改善实验结果。若多次CUT&RUN-qPCR结果不理想，可能与目的基因本身的富集程度有关，建议通过文库构建和测序手段判断目的基因是否有富集。

8.CUT&RUN-qPCR数据计算方法和结果体现形式？

推荐采用Fold Enrichment法进行计算，计算方法如下：

（1）统计处理组、对照组、阴性对照组中目的基因的C_T值和Spike in DNA的C_T值；

（2）以 Spike in DNA为内参，计算各组△C_T值。

实验组：△C_T_treatment= C_{T treatment}- C_T _{treatment Spike in}

对照组：△C_T_control=C_T_control- C_T_control _Spike in

阴性对照：△C_{T IgG}= C_{T IgG}- C_{T IgG Spike in}

（3）以阴性对照IgG为参照，计算各组2^-△△C^T值。

Relative Enrichment fold _treatment= 2^-(△C_^T^treatment^-^{△C_{T IgG}）}

Relative Enrichment fold _control= 2^-(△C^{_T control-△C_{T IgG}）}

Relative Enrichment fold _IgG= 2^-(△C_^T^IgG^-△C_{^{T IgG}}^）=1