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Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR

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    2023-10-27 09:26:04
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Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR

快速高效靶向切割目的片段,无需建库即可实现基因定量
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HD101-01/02
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Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR

快速高效靶向切割目的片段,无需建库即可实现基因定量。

蛋白质-DNA互作

·  操作体验好:实验流程简单,包含DNA提取模块,告别酚氯仿抽提。

·  产品性能好:转录因子、辅因子成功率高,产出更稳定,结果更真实。

·  结果更准确:含有Spike in DNA组分,校正组间差异。

·  区分下游实验:无需建库,可直接进行qPCR,满足不同实验需求。

Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR是用于研究蛋白质-DNA相互作用的试剂盒。CUT&RUN(Cleavage Under Target and Release Using Nuclease)技术是一种研究蛋白质-DNA相互作用的新方法,使用Protein G融合的MNase核酸酶,在抗体引导下精准靶向目的蛋白,并在目的位点附近进行DNA的片段化切割。本试剂盒优化了实验反应体系和操作流程,与传统的ChIP-qPCR相比,具有检测成功率高、抗体兼容性强、实验周期短、操作简单等优势,尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。试剂盒中所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,较大程度上保证了实验结果的稳定性和重复性。

1. 目的蛋白兼容性

以10,000和100,000个239细胞为样本,在不同靶蛋白体系中,针对不同的目的基因富集片段设计qPCR引物,均可以成功进行qPCR扩增。结果表明HD101可兼容不同类型、不同丰度的靶蛋白,目的基因片段富集效果好。

图1  293细胞中H3K4me3、H3K27me3、CTCF、Ezh2互作DNA的富集程度

 

2. 细胞类型兼容性测试

在293、Hela、K562三种不同细胞类型中,针对组蛋白H3K4me3和转录因子CTCF设计目的基因qPCR引物,可以成功富集目的片段,并进行qPCR扩增,结果表明HD101在不同的细胞类型中发挥稳定。

图2 不同类型细胞中H3K4me3、CTCF互作DNA的富集程度

 

3. 细胞投入量兼容性测试

投入5,000、10,000、100,000、500,000个293细胞,针对组蛋白H3K4me3和转录因子CTCF设计目的基因qPCR引物,可以成功富集目的片段,并进行qPCR扩增,结果表明HD101在不同的细胞投入量下发挥稳定。

图3 不同细胞投入量下H3K4me3、CTCF互作DNA的富集程度

 

4. Spike in DNA校准测试

通过梯度投入Spike in DNA(1 pg / 10,000 cells)对不同细胞投入量测得的CT值进行均一化校正,校正后的CT值差值小于1,目的基因富集程度趋于一致。因此,HD101提供的Spike in DNA可实现样本间的均一化校准。

图4 Spike in DNA校正前后CT值的比较

BOX1:2 ~ 8 ℃保存,根据不同目的地调整运输方式;

BOX2:15 ~ 25 ℃保存,常温运输;

BOX3:-30 ~ -15 ℃保存,≤0℃运输。

关键词:
HD101
CUT&RUN文库构建
pG-MNase酶
CUT&RUN检测
CUT&RUN qPCR
CUT&RUN定量试盒
CUT&RUN试剂
蛋白质-DNA互作
核酸蛋白互作
靶向切割目的片段
HD101-00
未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

1. CUT&RUN适用于什么物种?

CUT&RUN Protocol广泛适用于常规哺乳动物细胞的蛋白质-DNA互作研究,酵母、植物等细胞需要经过特殊的处理后进行实验,但是细胞投入量不宜过低,较低细胞投入量下实验结果较差。

 

2. ConA磁珠主要作用是什么?

ConA磁珠经过刀豆蛋白A包被,能与细胞膜上的糖蛋白结合,从而吸附细胞,使细胞处理操作可视化,以减少在后续实验过程中细胞的损失。

 

3. CUT&RUN能否使用二抗?

进行CUT&RUN实验时通常不需要二抗,当使用亲和力较低的一抗,或靶蛋白丰度较低时,可以考虑二抗。但必须要说的是,MNase的切割活性很强,我们在CUT&RUN整个实验流程做出的努力是为了限制MNase的活性,较大程度避免非特异性切割,加入二抗会增加非特异性切割的概率,导致背景偏高,因此请慎重选择是否使用二抗。

 

4. CUT&RUN 对常/异染色质的切割是否存在偏好性?

否,CUT&RUN对常染色质或异染色质无任何偏向性。在CUT&RUN中,无论是常染色质还是异染色质,靶蛋白特异性抗体募集 pG-MNase,并将切割引导至与该抗体直接相邻的染色质。在这种情况下,即使在较难接近的异染色质中,pG-MNase也能与染色质产生有效束缚并发生切割。

 

5. qPCR熔解曲线出现多峰的原因?

引物设计不优,推荐qPCR引物扩增长度在100 - 200 bp之间,按照引物设计原则进行设计。

 

6. CUT&RUN实验时需要做阳性对照和阴性对照吗?

根据实际需求判断是否需要阳性对照和阴性对照。一般来说,阳性对照是为了排除实验环境不佳、实验操作不当、样本处理不合格等因素,通常选择丰度较高的组蛋白(如H3K4me3)或转录因子(如CTCF)作为阳性对照,阳性对照不是必需的。阴性对照的作用主要是排除非特异性切割,通常选择IgG或不加一抗作为阴性对照。

 

7. 在高低丰度组蛋白及转录因子体系中,CUT&RUN-qPCR的测试结果?

以100,000 293细胞为样本,分别对兴奋性组蛋白体系H3K4me3、抑制性组蛋白体系H3K27me3、转录因子体系CTCF和RNA pol II进行CUT&RUN-qPCR实验,结果如下图所示。

图1 不同体系的CUT&RUN-qPCR结果

HD101可以兼容高中低丰度组蛋白以及转录因子体系,可以兼容抑制性组蛋白修饰靶点,低丰度体系为了获得更好的qPCR结果,建议尝试设计多对特异性高且丰度相对较高的qPCR扩增靶点,推荐qPCR引物扩增长度在100 - 200 bp左右,按照引物设计原则进行设计。当IgG CT值与特异性靶点CT值相差较小时,可以通过缩短pG-MNase消化时间、增加细胞投入量以改善实验结果。 若多次CUT&RUN-qPCR结果不理想,可能与目的基因本身的富集程度有关,建议通过文库构建和测序手段判断目的基因是否有富集。

 

8.CUT&RUN-qPCR数据计算方法和结果体现形式?

推荐采用Fold Enrichment法进行计算,计算方法如下:

(1)统计处理组、对照组、阴性对照组中目的基因的CT值和Spike in DNA的CT值;

(2)以 Spike in DNA为内参,计算各组△CT值。

实验组:△CT treatment = CT treatment - CT treatment Spike in

对照组:△CT control =CT control - CT control Spike in

阴性对照:△CT IgG = CT IgG - CT IgG Spike in

(3)以阴性对照IgG为参照,计算各组2-△△CT值。

Relative Enrichment fold treatment = 2-(△CT treatment - △CT IgG

Relative Enrichment fold control = 2-(△CT control-△CT IgG

Relative Enrichment fold IgG = 2-(△CT IgG-△CT IgG=1

若无处理组和对照组,可直接比较实验组和阴性对照组中目的基因的CT值。以计算CTCF(投入100,000 293细胞)Target基因片段PAX、HLA的富集效果为例:

Target

CT Value

Average CT

PAX

25.16

24.85

25.08

25.03

Spike in DNA

16.53

16.52

16.74

16.59

△CT PAX = CT PAX - CT PAX Spike in = 25.03-16.59 = 8.44

Target

CT Value

Average CT

IgG

27.85

27.62

27.44

27.63

Spike in DNA

15.46

15.18

15.76

15.46

△CT IgG = CT IgG - CT IgG Spike in = 27.63-15.46 = 12.17

Relative Enrichment fold PAX= 2-(CT PAX - CT IgG= 2-(8.44-12.17) = 13.27

Relative Enrichment fold IgG = 2-(CT IgG - CT IgG= 2-(12.17-12.17) =1

 

Target

CT Value

Average CT

HLA

26.87

26.85

27.02

25.06

Spike in DNA

16.53

16.52

16.74

16.59

△CT HLA = CT HLA - CT HLA Spike in = 25.03-16.59 = 8.47

Target

CT Value

Average CT

IgG

28.53

28.16

28.32

28.34

Spike in DNA

15.46

15.18

15.76

15.46

△CT IgG = CT IgG - CT IgG Spike in = 28.34-15.46 = 12.88

Relative Enrichment fold HLA = 2-(CT HLA - CT IgG= 2-(8.47-12.88) = 21.26

Relative Enrichment fold IgG = 2-(CT IgG - CT IgG= 2-(12.88 -12.88) =1

图2 293细胞中PAX、HLA相对富集倍数

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