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Anti-mouse IgG for IP (HRP)

摆脱IP轻重链干扰，准确捕获互作蛋白！
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Anti-mouse IgG for IP (HRP)

摆脱IP轻重链干扰，准确捕获互作蛋白！

IP/CoIP实验

特异性好：避免IP/CoIP实验轻重链干扰

Anti-mouse IgG for IP (HRP)是一款仅与天然IgG反应，不与变性和还原鼠IgG重链或轻链结合的构象特异性二抗。相较于常规的Anti-IgG (H&L)酶标二抗，本产品在免疫沉淀(IP)后进行Western blot检测时，不识别IP抗体的重链(55 kDa)和轻链(25 kDa)，特异性更好，便于靶蛋白的检测。

特异性好：RA1009能有效解决IP/CoIP实验轻重链干扰问题

使用p53 Mouse mAb (泳道3)免疫沉淀293F细胞的p53。泳道1为 Input，泳道2为IgG。以p53 Mouse mAb作为一抗检测所有泳道， 二抗包括Anti-mouse IgG for IP (HRP) #RA1009 (Fig A)和Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) (Fig B)。

使用Erk1/2 Mouse mAb (泳道2)免疫沉淀HeLa细胞的Erk1/2。泳道1为Input。以Erk1/2 Mouse mAb作为一抗检测所有泳道，二抗包括Anti-mouse IgG for IP (HRP) #RA1009 (Fig C)和Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) (Fig D)。

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Q1：IP背景高或出现非特异性信号

A1：(1) 非特异性蛋白质与珠子结合：珠子用BSA预封闭不充分，确保BSA新鲜，新鲜珠子与含1% BSA的PBS孵育1小时，之后用PBS洗3-4次；

(2) 抗体浓度过高：检查推荐抗体用量；适度降低抗体添加量；

(3) 免疫沉淀实验时抗原降解：确保样品裂解时加入新鲜的蛋白酶抑制剂或新鲜制备样本；

(4) 抗体特异性不够：使用亲和纯化的抗体；

(5）封闭时间不充分：延长封闭时间；在不影响后续实验情况下，推荐采用含有5%脱脂奶粉进行封闭。

Q2：IP出现轻重链干扰目的带，呈现假阳性或假阴性

A2：普通Anti-IgG(H+L)酶标二抗会同时识别原先的IP抗体（经洗脱变性后断裂为轻链和重链）和WB抗体，导致膜上至少出现三条不同的带，或者出现轻重链信号信号过强，导致目的蛋白信号弱，严重干扰实验结果：可以采用构象特异性二抗避免轻重链干扰。

Q3：IP无信号或目的条带很弱

A3：(1) 显影液失效：通过检查显影液清澈度初判，并通过立即更换新显影液后再曝；

(2) 底物失效：TBST润洗膜几次，重新加合格的底物；

(3) 二抗浓度过高或孵育时间过长：降低二抗浓度；减少孵育时间；

(4) 目标蛋白没有从珠子上洗脱：确保洗脱缓冲液是洗脱蛋白质所需的正确强度及正确pH值；

(5) 抗体未与珠子结合：确保使用的珠子与抗体亚型匹配，增加抗体与磁珠孵育的时间或增加磁珠的量；

(6) 表位掩蔽：尝试一种识别靶标蛋白不同区域内表位的抗体；

(7) 抗体选择不当：未选用合适的IP级抗体；

(8) 二抗选择不当：WB二抗未选用与使用的一抗相同的物种来源；

(9) 蛋白提取不充分或存在降解：更换合适的裂解液，添加相应的蛋白酶抑制剂；

(10) 目的蛋白在样品中低表达：样本可短暂超声处理，离心取上清进行后续实验。

Q4：IP条带正确，但显影过强或过弱

A4：(1) 目的蛋白或抗体用量过大：可减少上样量、提高一抗稀释度并缩短曝光时间；

(2) 目的蛋白或抗体用量过小：可增加上样量、降低一抗稀释度并延长曝光时间。

Q5：Input泳道无目的带，而IP泳道有

A5：目的蛋白丰度不高，无法直接通过WB检出，而 IP 能进行浓缩富集。

Q6：Input泳道有目的带，而IP泳道无

A6：(1) 该种一抗主要识别和结合靶蛋白内部的线性表位、而非暴露在外表的的线性或空间表位，故IP制样时无法有效捕获住组织或细胞中的天然结构靶蛋白；

(2) 抗体亲和力低。一般而言，相比于WB，IP实验需要更高亲和力的抗体。

Q7：WB条带异常

A7：(1) 微笑条带，电泳温度过高：降低迁移速度或低温电泳（置于冰上）；

(2) 条带拖尾（糖基化蛋白/裂解不完全）：糖基化蛋白：不同的糖基化通常导致在分子量高于预测的分子量处产生条带拖尾效应，建议样本使用 PNGase F处理；裂解不完全：建议进行超声处理；

(3) 条带偏斜，电极不平衡或者加样位置偏斜：调整电泳仪器；缓慢平稳加样；

(4) 条带两边扩散，样品中盐离子浓度过高：重新制备样本，去除盐离子干扰；

(5) 暗片白条带，一抗或二抗加入过多：适当稀释抗体浓度。

Q8：WB背景高

A8：(1) 蛋白含量过高：减少蛋白上样量或稀释蛋白样本液；

(2) 抗体浓度过高：建议适当增加标签抗体稀释倍数；

(3) 二抗交叉反应：建议适当增加二抗稀释倍数；

(4) 标签抗体与天然存在的类似标签蛋白表位发生交叉反应：在封闭、抗体孵育和洗膜步骤中将温度升高至37℃可能会降低交叉反应性。设置转染对照（用非重组质粒转染）的裂解物有助于区分标签融合蛋白和其他交叉反应蛋白；

(5) 洗膜不充分：少量多次洗涤；适当增加洗涤剂强度，如Tween-20换成NP-40；

(6) 过程中膜干燥：全程保持膜湿润；

(7) 封闭不充分/封闭液选择出错：延长封闭时间；增加封闭蛋白浓度；更换封闭液，如BSA。

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Anti-rabbit IgG for IP (HRP)
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