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Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2

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Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2

一步实现目标质粒单/双位点突变
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货号：
C214-01/02
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快速定点突变
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Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2

一步实现目标质粒单/双位点突变

DNA单/双位点突变

模板使用量低：扩增以指数方式进行，有利于原始甲基化模板的降解
操作简便：扩增产物经DpnI消化后可直接用于重组反应；可对目标质粒上单个位点或两个不连续位点( 相距超过50 bp) 同时进行定点突变
广泛适用：适用于20 kb以内质粒任意位点的扩增
设计简单：提供在线引物设计软件CE Design

实验流程:

本试剂盒是基于ClonExpress快速克隆技术的定点突变系统，目标质粒扩增产物经DpnI消化、ClonExpress重组环化后直接进行转化即可完成定点突变，操作简便，成功率高。该试剂盒由Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase扩增模块和ClonExpress快速克隆模块组成，扩增模块较高的保真度降低了扩增过程中引入新突变的可能性，高效同源重组反应替代了传统的退火成环反应。

- 20℃储存

关键词:
C214
快速定点突变；定点突变；单点突变；多点突变；点突变；基因定点突变；突变；一步法单点突变；一步法多点突变；基因突变；克隆；DNA多位点突变；DNA单位点突变；分子克隆
未找到相应参数组，请于后台属性模板中添加

Q1： 点突变引物设计

  1. 引物由两部分组成：反向互补序列（15-20 bp，GC含量40%-60%）+非互补序列（至少15bp)，待突变位点至引物3'端Tm值>60℃为佳，待突变位点至引物5'端区域内碱基不应参与Tm值计算。
  2. 引物设计：官网引物设计软件CE Design，选择相应模块进行设计。

 

Q2：质粒模板无法正常扩增

  1. 引物设计有误：核对引物设计方案，建议用官网引物设计软件CE Design进行设计。
  2. 模板质粒：质粒质量偏差会影响扩增效率，长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板（建议质粒模板测序验证序列无问题）；质粒如果太大（>9kb），扩增有一定的难度。
  3. 扩增体系：质粒模板投入量过多，模板投入量过多会抑制PCR反应，导致PCR产物很少，建议50μl体系投入1ng质粒模板；检查体系配制是否错误。
  4. 扩增反应条件需优化：调整Mg2+浓度、酶量、摸索退火温度等。
  5. 若质粒过长不容易扩增或扩增效率极低，可以将单碱基突变方案改为双碱基突变：其中一个位点不进行碱基修改即可。

 

Q3：平板上长不出克隆或者克隆数很少。

  1. 感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率需＞107 cfu/μg。每次可设置一组转化质粒的对照试验，以检测感受态细胞的转化效率；
  2. 重组反应体系中DNA量不足或比例不佳（双碱基突变）：尽量按照说明书推荐的量配置重组体系。请务必预先检测DpnI消化产物的浓度。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大；
  3. 重组环化反应体系中DNA不纯，抑制反应：未纯化DpnI消化产物加入重组体系内的总体积不应超过4ul（反应体系体积1/5）。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂（如EDTA）的带入。因此，我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH2O中保存（常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的ddH2O替代），请勿使用TE进行DNA保存；
  4. 感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率； 
  5. 出现转化抑制效应：当转化的DNA浓度太高时，会抑制转化反应，将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。

 

Q4: 非目标位点突变

  1. 测序：如果只测了一个样本，不一定可信，需要多测几个样本；检查突变处的测序信号是否有问题，若为双峰或者杂峰则不一定可信。
  2. 若突变位点一致，可能是模板质粒携带位置为点突变，测序确认模板质粒序列正确性。
  3. 扩增循环数过多：为了防止扩增过程中引入非目标突变，扩增循环数不宜超过35。如果扩增效率良好的话，推荐扩增循环数不应超过30。

 

 

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60.00
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DL5000 DNA Marker
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DL 15000 DNA Marker
75.00
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100 bp DNA Ladder
90.00
100 bp DNA Ladder
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2 × Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）
290.00
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DH5α 化学感受态细胞
160.00
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XL10化学感受态细胞
265.00
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