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Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2

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Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2

Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 一步法单 / 双点突变试剂盒 Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶提供保真度高的PCR 反应        扩增以指数方式进行,模板使用量低,有利于原始甲基化模板的彻底降解        扩增产物经DpnI 消化后可直接用于重组反应        可对目标质粒上单个位点或两个不连续位点( 相距超过50 bp) 同时进行定点突变 提供在线引物设计软件CE Design 实验流程: Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 是基于ClonExpress® 快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒,目标质粒扩增产物经DpnI 消化、ClonExpress® 重组环化后直接进行转化即可完成定点突变。该试剂盒由Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 扩增模块和ClonExpress® 快速克隆模块组成。Phanta® MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 较高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性,ClonExpress® 快速克隆系统利用高效同源重组反应替代了传统的退火成环反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及高的成功率,使得Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 成为DNA 定点突变选用试剂盒。 - 20℃储存
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Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2

一步法单 / 双点突变试剂盒

Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶提供保真度高的PCR 反应

扩增以指数方式进行,模板使用量低,有利于原始甲基化模板的彻底降解
扩增产物经DpnI 消化后可直接用于重组反应
可对目标质粒上单个位点或两个不连续位点( 相距超过50 bp) 同时进行定点突变

提供在线引物设计软件CE Design

实验流程:

Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 是基于ClonExpress® 快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒,目标质粒扩增产物经DpnI 消化、ClonExpress® 重组环化后直接进行转化即可完成定点突变。该试剂盒由Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 扩增模块和ClonExpress® 快速克隆模块组成。Phanta® MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 较高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性,ClonExpress® 快速克隆系统利用高效同源重组反应替代了传统的退火成环反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及高的成功率,使得Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 成为DNA 定点突变选用试剂盒。

- 20℃储存

关键词:
C214-01/02
一步法单/双点突变试剂盒
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Q1: 点突变引物设计

  1. 引物由两部分组成:反向互补序列(15-20 bp,GC含量40%-60%)+非互补序列(至少15bp),待突变位点至引物3'端Tm值>60℃为佳,待突变位点至引物5'端区域内碱基不应参与Tm值计算。
  2. 引物设计:官网引物设计软件CE Design,选择相应模块进行设计。

 

Q2:质粒模板无法正常扩增

  1. 引物设计有误:核对引物设计方案,建议用官网引物设计软件CE Design进行设计。
  2. 模板质粒:质粒质量偏差会影响扩增效率,长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的质粒作为模板(建议质粒模板测序验证序列无问题);质粒如果太大(>9kb),扩增有一定的难度。
  3. 扩增体系:质粒模板投入量过多,模板投入量过多会抑制PCR反应,导致PCR产物很少,建议50μl体系投入1ng质粒模板;检查体系配制是否错误。
  4. 扩增反应条件需优化:调整Mg2+浓度、酶量、摸索退火温度等。
  5. 若质粒过长不容易扩增或扩增效率极低,可以将单碱基突变方案改为双碱基突变:其中一个位点不进行碱基修改即可。

 

Q3:平板上长不出克隆或者克隆数很少。

  1. 感受态效率低:使用新制备或妥善冻存的感受态细胞,确保转化效率需>107 cfu/μg。每次可设置一组转化质粒的对照试验,以检测感受态细胞的转化效率;
  2. 重组反应体系中DNA量不足或比例不佳(双碱基突变):尽量按照说明书推荐的量配置重组体系。请务必预先检测DpnI消化产物的浓度。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响,测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大;
  3. 重组环化反应体系中DNA不纯,抑制反应:未纯化DpnI消化产物加入重组体系内的总体积不应超过4ul(反应体系体积1/5)。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂(如EDTA)的带入。因此,我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的ddH2O替代),请勿使用TE进行DNA保存;
  4. 感受态细胞中加入了过多的反应产物:反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率; 
  5. 出现转化抑制效应:当转化的DNA浓度太高时,会抑制转化反应,将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。

 

Q4: 非目标位点突变

  1. 测序:如果只测了一个样本,不一定可信,需要多测几个样本;检查突变处的测序信号是否有问题,若为双峰或者杂峰则不一定可信。
  2. 若突变位点一致,可能是模板质粒携带位置为点突变,测序确认模板质粒序列正确性。
  3. 扩增循环数过多:为了防止扩增过程中引入非目标突变,扩增循环数不宜超过35。如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数不应超过30。

 

 

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