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ClonExpress II One Step Cloning Kit

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    C112说明书-V22.1.pdf

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    2022-05-26 14:33:51
  • cp

    【C112中阳性对照载体】-pUC19(1).docx

    大小:
    2022-09-14 15:03:19
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ClonExpress II One Step Cloning Kit

ClonExpress®IIOneStepCloningKit  非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒  简单、快速、高效,适用于任何载体无需考虑插入片段携带的酶切位点可高效克隆50bp-10kb的DNA片段线性化克隆载体和PCR产物可不纯化直接克隆无连接酶,无自连,阳性率>95%  克隆效率极高       图1.重组产物转化后平板上一般可形成数千个单克隆,而无插入片段的阴性对照反应转化后只有数个
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货号:
C112-01/02
所属分类
快速克隆
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ClonExpress® II One Step Cloning Kit 

非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒

简单、快速、高效,适用于任何载体

无需考虑插入片段携带的酶切位点

可高效克隆 50 bp-10 kb 的 DNA 片段

线性化克隆载体和 PCR 产物可不纯化直接克隆

无连接酶,无自连,阳性率 >95%

提供在线引物设计软件CE Design

1.克隆效率高

图1

重组产物转化后平板上一般可形成数千个单克隆,而无插入片段的阴性对照反应转化后只有数个单克隆形成。因此ClonExpress® 系统的自连背景会大大降低连接酶依赖的克隆方式。

 

2.克隆阳性率95%以上

图2 

鉴定酶切结果表明,克隆阳性率可达95%以上。

ClonExpress® 技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术,可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。 ClonExpress® II 是新一代重组克隆试剂盒,包含增强的重组酶 Exnase® II。使用任意方式将载体进行线性化;在插入片段正 / 反向 PCR 引物 5’ 端引入线性化载体的末端序列,使得 PCR 产物 5’ 和 3’ 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列 (15 bp-20 bp)。这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化载体按一定比例混合后,在Exnase®II 重组酶的催化下,仅需反应 30 min 即可进行转化,完成定向克隆,阳性率可达 95% 以上。

- 30℃~-15℃保存

关键词:
C112-01/02
非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒
未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:引物如何设计?

引物由三部分组成:同源臂(15-20 bp,不计算酶切位点和残留碱基,GC含量40%-60%)+酶切位点(按需保留或舍弃)+特异性引物(引物Tm值由特异性序列决定,计算不包括同源臂和酶切位点的序列)

  1. 引物设计:官网引物设计软件CE Design,选择相应模块进行设计。
  2. 载体的线性化方式有三种:双酶切、单酶切和反向PCR,优先选择双酶切;

 

Q2:阳性对照不长斑或很少。

  1. 平板抗性使用错误:C112,C113试剂盒中提供的对照载体的抗性为Amp+抗性,C115对照载体的抗性为Amp+,Kan+双抗性;
  2. 感受态细胞效率低:确保转化效率>107cfu/μg,可进行简单检测,将1 ng质粒转化至100 μl感受态细胞中,取1/10进行涂板,生长1000个菌斑,估算感受态转化效率为107cfu/μg;重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率;感受态选择克隆感受态(如DH5α/XL10),不能用表达感受态。

 

Q3:平板上长不出克隆/克隆数很少/空载体

  1. 阳性对照:用于排查是否因为操作原因、感受态效价下降、试剂酶活下降导致的重组效率低。
  2. 引物设计不正确:引物包含15-20 bp同源臂(不计算酶切位点),GC含量40%-60%;若同源臂的长度小于13bp或者大于35bp,基本没有重组活性,长度大于25bp,重组效率会有明显下降;GC含量过高或过低,会影响重组效率。
  3. 载体线性化方式:尽量选用双酶切,若为快速酶切,建议延长酶切时间(若无星号活性可以过夜酶切),减少质粒的投入量,采用胶回收进行纯化以降低载体未被切开的概率,也可以做阴性对照来验证载体线性化程度。
  4. 载体和插入片段未切胶回收:未纯化DNA有可能会抑制重组反应, 建议线性化载体、PCR产物进行凝胶回收纯化,纯化产物溶解在ddH2O中。
  5. 线性化克隆载体和插入片段浓度测定不准确。如果使用NanoDrop测定浓度,必须保证浓度值大于20ng/μl,同时OD260/280在1.8附近,才能保证得到的浓度较为准确,否则需要跑胶鉴定其浓度或重新制备片段(多管浓缩以增加回收浓度)。
  6. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量,即比例不佳:严格按照说明书推荐的量和比例配制重组体系,各组分添加不低于1μl(避免低体积添加造成量取不准)。
  7. 重组体系:对于C112/C113,重组体系为20μl,10μl重组体系容易造成重组效率低。
  8. 重组条件:反应需要在精密仪器中进行,如PCR仪、金属浴等,不建议在水浴锅、恒温箱中进行重组,后者可能因为温度不准确造成重组效率下降。
  9. 感受态细胞的转化效率需大于107cfu/μg,重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率;选择克隆用感受态细胞(如DH5α/XL10),不能选择表达用感受态细胞。若为自制的感受态细胞需要测定效价(将1ng质粒转化至100μl感受态细胞中,取1/10进行涂板,生长1000个菌斑,估算感受态转化效率为107cfu/μg),且涂板时需将感受态细胞全部涂在平板上;感受态转化温度准确。
  10. 增加重组效率的辅助手段:对于C112可以等比例减半载体与片段的投入量。
  11. 除此之外,需要检查抗生素抗性有未加错。

 

Q4:假阳性/测序无信号/空载体

  1. 阴性对照:用于排查是否是质粒载体残留导致的假阳性,如果阴性对照长了很多,可能是模板投入量过多或者未进行DpnI消化。
  2. 以质粒为模板PCR获得片段/载体:质粒投入量不宜过多(<1ng),否则可能导致DpnI消化不完全从而造成假阳性。建议PCR产物进行凝胶回收纯化,纯化产物溶解在pH 8.0的ddH2O中。
  3. 挑斑方法:建议选取平板上某一块区域,同时挑选大斑和小斑。主要原因是有以下几点:重组产物3'端与5'端未连接,需要到感受态细胞中进行修复,斑点相对来说会小点;另外板子营养不均匀会导致斑点大小有差异;重组质粒相对原始质粒来说,有可能会影响细胞的生长。所以建议挑取大小斑点,以增加挑到重组产物的概率。
  4. 菌检引物:建议使用载体通用引物或者引物一端在载体上,一端在目的片段上。如果用目的片段引物进行菌液PCR,可能会出现菌检有结果而测序无结果。

 

Q5:菌液PCR无条带

⑴ PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带,建议优化PCR体系、程序;或者提取质粒,以质粒做模板PCR验证,或进行酶切验证。

⑵ 重组失败:只有空质粒的条带,说明重组不成功,载体线性化不完全,建议优化酶切体系,检查引物设计。

⑶ PCR试剂不合适:试剂不适合粗品,或者是超出了试剂的使用范围,扩增的片段太大。

 

Q6:多数克隆含有不正确的插入片段

⑴ PCR产物混有非特异性产物:优化PCR体系,提高特异性;胶回收PCR产物;鉴定更多的克隆。

⑵ 反应体系中混入了相同抗性的质粒:PCR扩增模板为环状质粒时,如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnI消化,或者进行胶回收纯化。

 

Q7:插入片段出现碱基突变

  1. 测序的样本数:如果只测了一个样本,不一定可信,需要多测几个样本。
  2. 分析测序结果:检查突变处的测序信号是否有问题,若为双峰或者杂峰则不一定可信。
  3. 检查突变位点:如果多个结果突变位点一致,可能是从模板上的引入的或者模板序列与NCBI上不一致。
  4. 插入片段在PCR获得时使用高保真的聚合酶。
  5. 若引物处发生碱基突变,考虑是引物合成问题,建议重新合成引物进行实验。

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