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ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit

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    ClonExpress MultiS One Step...-V21.1.pdf

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    2021-11-26 17:37:09
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    【C113中阳性对照载体】-pUC19(1).docx

    大小：
    2022-09-14 15:03:19
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浏览量:
19967

ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit

非连接酶依赖型的多片段一步克隆技术
价格：
¥
520.0
市场价
元
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浏览量:
19967
货号：
C113-01/02
所属分类
快速克隆
数量：
-
+
库存:
79975
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ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 

非连接酶依赖型的多片段一步克隆技术

快速克隆；高通量克隆；无缝克隆；DNA定点突变；双链DNA与载体组装

·  可在几乎任何载体的任意位点进行多片段拼接克隆

·  无需考虑插入片段自身携带的酶切位点

·  可一次实现二至五个插入片段的顺序拼接

·  线性化克隆载体和 PCR 产物可不进行纯化直接克隆

·  提供在线引物设计软件CE Design

ClonExpress MultiS是针对多片段克隆开发，试剂盒中包含专门针对多片段重组优化的buffer和重组酶Exnase MultiS。首先将载体进行线性化，并在插入片段PCR引物5'-端引入线性化载体的末端序列；之后将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆，阳性率可达95%以上。使用本试剂盒，可以将多至五个片段一次性顺序拼接，简化了实验步骤。

- 20℃保存

关键词:
C113
重组克隆；无缝克隆；同源重组试剂盒；定向克隆；快速克隆；多片段重组；克隆；一步法快速克隆；克隆；快速重组克隆；一步克隆；多片段克隆；多片段一步克隆；DNA克隆；高通量克隆；DNA定点突变；双链DNA与载体组装；分子克隆
未找到相应参数组，请于后台属性模板中添加

Q1：引物如何设计？

引物由三部分组成：同源臂（15-20 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40%-60%）+酶切位点（按需保留或舍弃）+特异性引物（引物Tm值由特异性序列决定，计算不包括同源臂和酶切位点的序列）

  1. 引物设计：官网引物设计软件CE Design，选择相应模块进行设计。
  2. 载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切和反向PCR，优先选择双酶切；

 

Q2：阳性对照不长斑或很少。

  1. 平板抗性使用错误：C112，C113试剂盒中提供的对照载体的抗性为Amp+抗性，C115对照载体的抗性为Amp+,Kan+双抗性；
  2. 感受态细胞效率低：确保转化效率>107cfu/μg，可进行简单检测，将1 ng质粒转化至100 μl感受态细胞中，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算感受态转化效率为107cfu/μg；重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；感受态选择克隆感受态（如DH5α/XL10），不能用表达感受态。

 

Q3：平板上长不出克隆/克隆数很少/空载体

  1. 阳性对照：用于排查是否因为操作原因、感受态效价下降、试剂酶活下降导致的重组效率低。
  2. 引物设计不正确：引物包含15-20 bp同源臂（不计算酶切位点），GC含量40%-60%；若同源臂的长度小于13bp或者大于35bp，基本没有重组活性,长度大于25bp，重组效率会有明显下降；GC含量过高或过低，会影响重组效率。
  3. 载体线性化方式：尽量选用双酶切，若为快速酶切，建议延长酶切时间（若无星号活性可以过夜酶切），减少质粒的投入量，采用胶回收进行纯化以降低载体未被切开的概率，也可以做阴性对照来验证载体线性化程度。
  4. 载体和插入片段未切胶回收：未纯化DNA有可能会抑制重组反应， 建议线性化载体、PCR产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH2O中。
  5. 线性化克隆载体和插入片段浓度测定不准确。如果使用NanoDrop测定浓度，必须保证浓度值大于20ng/μl，同时OD260/280在1.8附近，才能保证得到的浓度较为准确，否则需要跑胶鉴定其浓度或重新制备片段（多管浓缩以增加回收浓度）。
  6. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，即比例不佳：严格按照说明书推荐的量和比例配制重组体系，各组分添加不低于1μl（避免低体积添加造成量取不准）。
  7. 重组体系：对于C112/C113，重组体系为20μl，10μl重组体系容易造成重组效率低。
  8. 重组条件：反应需要在精密仪器中进行，如PCR仪、金属浴等，不建议在水浴锅、恒温箱中进行重组，后者可能因为温度不准确造成重组效率下降。
  9. 感受态细胞的转化效率需大于107cfu/μg，重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；选择克隆用感受态细胞（如DH5α/XL10），不能选择表达用感受态细胞。若为自制的感受态细胞需要测定效价（将1ng质粒转化至100μl感受态细胞中，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算感受态转化效率为107cfu/μg），且涂板时需将感受态细胞全部涂在平板上；感受态转化温度准确。
  10. 增加重组效率的辅助手段：对于C112可以等比例减半载体与片段的投入量。
  11. 除此之外，需要检查抗生素抗性有未加错。

 

Q4：假阳性/测序无信号/空载体

  1. 阴性对照：用于排查是否是质粒载体残留导致的假阳性，如果阴性对照长了很多，可能是模板投入量过多或者未进行DpnI消化。
  2. 以质粒为模板PCR获得片段/载体：质粒投入量不宜过多(<1ng)，否则可能导致DpnI消化不完全从而造成假阳性。建议PCR产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在pH 8.0的ddH2O中。
  3. 挑斑方法：建议选取平板上某一块区域，同时挑选大斑和小斑。主要原因是有以下几点：重组产物3'端与5'端未连接，需要到感受态细胞中进行修复，斑点相对来说会小点；另外板子营养不均匀会导致斑点大小有差异；重组质粒相对原始质粒来说，有可能会影响细胞的生长。所以建议挑取大小斑点，以增加挑到重组产物的概率。
  4. 菌检引物：建议使用载体通用引物或者引物一端在载体上，一端在目的片段上。如果用目的片段引物进行菌液PCR，可能会出现菌检有结果而测序无结果。

 

Q5：菌液PCR无条带

⑴ PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证，或进行酶切验证。

⑵ 重组失败：只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系，检查引物设计。

⑶ PCR试剂不合适：试剂不适合粗品，或者是超出了试剂的使用范围，扩增的片段太大。

 

Q6：多数克隆含有不正确的插入片段

⑴ PCR产物混有非特异性产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。

⑵ 反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnI消化，或者进行胶回收纯化。

 

Q7：插入片段出现碱基突变

  1. 测序的样本数：如果只测了一个样本，不一定可信，需要多测几个样本。
  2. 分析测序结果：检查突变处的测序信号是否有问题，若为双峰或者杂峰则不一定可信。
  3. 检查突变位点：如果多个结果突变位点一致，可能是从模板上的引入的或者模板序列与NCBI上不一致。
  4. 插入片段在PCR获得时使用高保真的聚合酶。
  5. 若引物处发生碱基突变，考虑是引物合成问题，建议重新合成引物进行实验。

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FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit
220.00
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615.00
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