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ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit

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C115_pCE-Zero_vector序列信息.docx

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2020-12-10 17:14:30

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ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit

兼容单片段、多片段、入门克隆的一步法克隆试剂盒

价格：

800.0

市场价

元

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货号：

C115-01/02

所属分类

快速克隆

数量：

库存:

79973

*具体价格咨询当地业务员

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产品详情

FAQ

组分

说明书

相关文献

ClonExpressUltra One Step Cloning Kit

兼容单片段、多片段、入门克隆的一步法克隆试剂盒

快速克隆；高通量克隆；无缝克隆；DNA定点突变；双链DNA与载体组装

· 快速：5 - 15min快速重组

· 简单：一管式Mix，操作简便

· 高效：高效克隆50 bp～10 kb片段，阳性率>95%

· 兼容：单片段、多片段、入门克隆三合一

· 零背景：提供零背景、氨苄/卡那双抗性载体

· 提供在线引物设计：提供在线引物设计软件CE Design

1.高度简化的实验流程

通过PCR扩增，使插入片段5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15 - 20 bp)。用2 × ClonExpressMix，50℃反应5-15 min，进行重组。重组产物直接转化感受态细胞，平板上会形成数百个单克隆供阳性筛选。

2.优异的克隆效率

试剂盒能够高效克隆50 bp-10 kb片段，不同长度单片段50 bp、2 kb、4.5 kb、7.5 kb、10 kb；多片段：四个片段（3 kb）、三个片段（10 kb）、五个片段（3 kb）、五个片段（6 kb），纯化后分别与pCE-Zero vector进行同源重组，重组产物转化化学感受态细胞DH5α（Vazyme #C502），菌落数如下图所示。

试剂盒独特的非连接酶依赖体系，无载体自连，克隆阳性率高达95%以上。重组产物转化平板后，各挑取50个单克隆进行菌落PCR鉴定，不同长度插入片段阳性率如下图所示。

3.广泛的体系兼容性

试剂盒兼容1至5个片段同源重组，搭配Vazyme高保真酶，PCR产物可不经过纯化直接进行克隆。重组产物转化化学感受态细胞DH5α（Vazyme #C502），XL10（Vazyme #C503），Fast-T1（Vazyme #C505），得到较高克隆效率。

4.载体序列信息及测序方案

pCE-Zero vector载体，测序时使用通用测序引物（M13）即可。

本试剂盒作为新一代的重组克隆试剂盒，可快速、高效的将1 - 5个片段定向克隆至任意载体的任意位点。该试剂盒独特的非连接酶依赖体系，降低了载体自连背景，且无需考虑插入片段自身携带的酶切位点。操作简便快捷，50℃条件下仅需5 - 15 min即可完成重组反应。

组分	C115-01(25 rxns)	C115-02(50 rxns)
2 × ClonExpressMix	125 μl	2 × 125 μl
pCE-Zero vector，linearized (50 ng/μl) *	25 μl	50 μl
500bp control insert (20 ng/μl)	5 μl	5 μl

*双抗性载体：Amp⁺，Kan⁺

- 20℃保存。

C115

关键词:

C115

一步法快速克隆；一步定向克隆；一步法同源重组快速克隆；单片段重组；多片段重组

无缝克隆

重组克隆；同源重组；快速克隆；快速重组克隆；超快速克隆

单片段克隆；多片段克隆；一体化快速克隆；定向克隆；DNA克隆

Q1：引物如何设计？

引物由三部分组成：同源臂（15-20 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40%-60%）+酶切位点（按需保留或舍弃）+特异性引物（引物Tm值由特异性序列决定，计算不包括同源臂和酶切位点的序列）

引物设计：官网引物设计软件CE Design，选择相应模块进行设计。
载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切和反向PCR，优先选择双酶切；

Q2：阳性对照不长斑或很少。

平板抗性使用错误：C112，C113试剂盒中提供的对照载体的抗性为Amp+抗性，C115对照载体的抗性为Amp+,Kan+双抗性；
感受态细胞效率低：确保转化效率>107cfu/μg，可进行简单检测，将1 ng质粒转化至100 μl感受态细胞中，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算感受态转化效率为107cfu/μg；重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；感受态选择克隆感受态（如DH5α/XL10），不能用表达感受态。

Q3：平板上长不出克隆/克隆数很少/空载体

阳性对照：用于排查是否因为操作原因、感受态效价下降、试剂酶活下降导致的重组效率低。
引物设计不正确：引物包含15-20 bp同源臂（不计算酶切位点），GC含量40%-60%；若同源臂的长度小于13bp或者大于35bp，基本没有重组活性,长度大于25bp，重组效率会有明显下降；GC含量过高或过低，会影响重组效率。
载体线性化方式：尽量选用双酶切，若为快速酶切，建议延长酶切时间（若无星号活性可以过夜酶切），减少质粒的投入量，采用胶回收进行纯化以降低载体未被切开的概率，也可以做阴性对照来验证载体线性化程度。
载体和插入片段未切胶回收：未纯化DNA有可能会抑制重组反应，建议线性化载体、PCR产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH2O中。
线性化克隆载体和插入片段浓度测定不准确。如果使用NanoDrop测定浓度，必须保证浓度值大于20ng/μl，同时OD260/280在1.8附近，才能保证得到的浓度较为准确，否则需要跑胶鉴定其浓度或重新制备片段（多管浓缩以增加回收浓度）。
线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，即比例不佳：严格按照说明书推荐的量和比例配制重组体系，各组分添加不低于1μl（避免低体积添加造成量取不准）。
重组体系：对于C112/C113，重组体系为20μl，10μl重组体系容易造成重组效率低。
重组条件：反应需要在精密仪器中进行，如PCR仪、金属浴等，不建议在水浴锅、恒温箱中进行重组，后者可能因为温度不准确造成重组效率下降。
感受态细胞的转化效率需大于107cfu/μg，重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；选择克隆用感受态细胞（如DH5α/XL10），不能选择表达用感受态细胞。若为自制的感受态细胞需要测定效价（将1ng质粒转化至100μl感受态细胞中，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算感受态转化效率为107cfu/μg），且涂板时需将感受态细胞全部涂在平板上；感受态转化温度准确。
增加重组效率的辅助手段：对于C112可以等比例减半载体与片段的投入量。
除此之外，需要检查抗生素抗性有未加错。

Q4：假阳性/测序无信号/空载体

阴性对照：用于排查是否是质粒载体残留导致的假阳性，如果阴性对照长了很多，可能是模板投入量过多或者未进行DpnI消化。
以质粒为模板PCR获得片段/载体：质粒投入量不宜过多(<1ng)，否则可能导致DpnI消化不完全从而造成假阳性。建议PCR产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在pH 8.0的ddH2O中。
挑斑方法：建议选取平板上某一块区域，同时挑选大斑和小斑。主要原因是有以下几点：重组产物3'端与5'端未连接，需要到感受态细胞中进行修复，斑点相对来说会小点；另外板子营养不均匀会导致斑点大小有差异；重组质粒相对原始质粒来说，有可能会影响细胞的生长。所以建议挑取大小斑点，以增加挑到重组产物的概率。
菌检引物：建议使用载体通用引物或者引物一端在载体上，一端在目的片段上。如果用目的片段引物进行菌液PCR，可能会出现菌检有结果而测序无结果。

Q5：菌液PCR无条带

⑴ PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证，或进行酶切验证。

⑵ 重组失败：只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系，检查引物设计。

⑶ PCR试剂不合适：试剂不适合粗品，或者是超出了试剂的使用范围，扩增的片段太大。

Q6：多数克隆含有不正确的插入片段

⑴ PCR产物混有非特异性产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。

⑵ 反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnI消化，或者进行胶回收纯化。

Q7：插入片段出现碱基突变