5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit
基于拓扑异构酶的平末端/TA兼容性入门克隆试剂盒
TA克隆;平末端克隆
· 兼容:能够同时兼容TA克隆和平末端克隆;
· 快速:加入片段,反应5 min即可。
· 高效:克隆效率高且阳性率>95%。
1.兼容性强
2.简单快速
3.阳性率高:使用插入片段为1kb,转化后随即挑取单克隆进行菌落PCR鉴定,Marker为诺唯赞DL5000 DNA Marker(MD102)
本产品作为第二代TOPO克隆试剂盒,包含有第二代Topoisomerase和自杀基因ccdB的载体,当插入片段与载体成功连接时,破坏ccdB正确表达,宿主细胞能够正常生长,否则宿主细胞不能正常生长,从而实现“Zero”背景。第二代Topoisomerase与合适buffer配合,活性更高,进一步提高克隆效率,室温5 min完成高效连接。此外,本试剂盒还添加了平末端化因子,可同时兼容TA克隆与平末端克隆。
组分 |
C601-01(25 rxns) |
C601-02(50 rxns) |
5×TA/Blunt-Zero Cloning Mixa |
25 μl |
2 × 25 μl |
500 bp Control insert(20 ng/μl) |
5 μl |
10 μl |
M13 Primer Mix(10 μM)b |
200 μl |
400 μl |
a.包含Topoisomerase和pCE2 TA/Blunt-Zero Vector(双抗性载体:Amp+,Kan+)
b.包含M13 Forward Primer 和M13 Reverse Primer
-30~-15°C保存,可于-20~0°C运输。
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Q1:平板上长不出克隆/克隆数很少/空载体
- 插入片段必须为PCR产物,而不能为酶切产物,而且插入片段引物5’端不能为磷酸化。
- 插入片段长度选择:插入片段的长度在50bp-10kb;
- 如果插入片段回收浓度较低时(<20ng/μl),需要重新制备插入片段,多管浓缩,以提升插入片段浓度,同时跑胶确保PCR产物的完整性。若插入片段回收浓度较高,需将其稀释以保证其添加体积数≥1μl。
- 按照说明书推荐公式对插入片段投入量进行计算,避免小体积(小于1μl)加入体系中
- 可以延长克隆时间至30min,反应最好是在PCR仪中进行。
- 合适的克隆温度为25℃。
Q2:菌液PCR无条带
⑴ PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带,建议优化PCR体系、程序;或者提取质粒,以质粒做模板PCR验证,或进行酶切验证。
⑵ 重组失败:只有空质粒的条带,说明重组不成功,载体线性化不完全,建议优化酶切体系,检查引物设计。
⑶ PCR试剂不合适:试剂不适合粗品,或者是超出了试剂的使用范围,扩增的片段太大。
Q3:多数克隆含有不正确的插入片段
⑴ PCR产物混有非特异性产物:优化PCR体系,提高特异性;胶回收PCR产物;鉴定更多的克隆
⑵ 反应体系中混入了相同抗性的质粒:PCR扩增模板为环状质粒时,如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnI消化,或者进行胶回收纯化
Q4:插入片段出现碱基突变
- 测序的样本数:如果只测了一个样本,不一定可信,需要多测几个样本。
- 分析测序结果:检查突变处的测序信号是否有问题,若为双峰或者杂峰则不一定可信。
- 检查突变位点:如果多个结果突变位点一致,可能是从模板上的引入的或者模板序列与NCBI上不一致。
- 插入片段在PCR获得时使用高保真的聚合酶。
- 若引物处发生碱基突变,考虑是引物合成问题,建议重新合成引物进行实验。
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