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    C601_pCE2-TA-Blunt-Zero_vector序列信息.docx

    大小:
    2020-12-10 18:12:46
  • C601_pCE2_TA-Blunt-Zero.gb

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    2020-12-10 18:12:46
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    5 min TA Blunt-Zero Cloning Kit-V21.1.pdf

    大小:
    2021-09-23 09:53:21
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5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit

5minTA/Blunt-ZeroCloningKit 基于拓扑异构酶的超快速克隆试剂盒 兼容:能够同时兼容TA克隆和平末端克隆;快速:加入片段,反应5min即可。 高效:克隆效率高且阳性率>95%。  兼容性强 简单快速 阳性率高:使用插入片段为1kb,转化后随即挑取单克隆进行菌落PCR鉴定,Marker为诺唯赞DL5000DNAmarker(MD104)  本产品是第二代TOPO克隆试剂盒,包
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966.0
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货号:
C601-01/02
所属分类
拓扑克隆
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-
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组分
说明书

5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit

基于拓扑异构酶的超快速克隆试剂盒

兼容:能够同时兼容TA克隆和平末端克隆;

快速:加入片段,反应5 min即可。

高效:克隆效率高且阳性率>95%。

1.兼容性强

2.简单快速

 

3.阳性率高:使用插入片段为1kb,转化后随即挑取单克隆进行菌落PCR鉴定,Marker为诺唯赞DL5000 DNA Marker(MD102)

本产品是第二代TOPO克隆试剂盒,包含第二代Topoisomerase、含有自杀基因ccdB的载体以及平末端因子。使用第二代Topoisomerase,配合最适的buffer,活性更高,进一步提高克隆效率,室温5 min完成高效连接。使用含有自杀基因ccdB的载体,当插入片段与载体成功连接时,破坏ccdB正确表达,宿主细胞能够正常生长,否则宿主细胞不能正常生长,从而实现“Zero”背景。添加平末端化因子,使得本产品能够同时兼容TA克隆与平末端克隆。

组分

C601-01(25 rxns)

C601-02(50 rxns)

5×TA/Blunt-Zero Cloning Mixa

25 μl

2 × 25 μl

500 bp Control insert(20 ng/μl)

5 μl

10 μl

M13 Primer Mix(10 μM)b

200 μl

400 μl

a.包含Topoisomerase和pCE2 TA/Blunt-Zero Vector(双抗性载体:Amp+,Kan+)

b.包含M13 Forward Primer 和M13 Reverse Primer

-30~-15°C保存,可于-20~0°C运输。

关键词:
C601-01/02
基于拓扑异构酶的超快速克隆试剂盒
未找到相应参数组,请于后台属性模板中添加

Q1:平板上长不出克隆/克隆数很少/空载体

  1. 插入片段必须为PCR产物,而不能为酶切产物,而且插入片段引物5’端不能为磷酸化。
  2. 插入片段长度选择:插入片段的长度在50bp-10kb;
  3. 如果插入片段回收浓度较低时(<20ng/μl),需要重新制备插入片段,多管浓缩,以提升插入片段浓度,同时跑胶确保PCR产物的完整性。若插入片段回收浓度较高,需将其稀释以保证其添加体积数≥1μl。
  4. 按照说明书推荐公式对插入片段投入量进行计算,避免小体积(小于1μl)加入体系中
  5. 可以延长克隆时间至30min,反应最好是在PCR仪中进行。
  6. 最佳克隆温度为25℃。

 

Q2:菌液PCR无条带

⑴ PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带,建议优化PCR体系、程序;或者提取质粒,以质粒做模板PCR验证,或进行酶切验证。

⑵ 重组失败:只有空质粒的条带,说明重组不成功,载体线性化不完全,建议优化酶切体系,检查引物设计。

⑶ PCR试剂不合适:试剂不适合粗品,或者是超出了试剂的使用范围,扩增的片段太大。

 

Q3:多数克隆含有不正确的插入片段

⑴ PCR产物混有非特异性产物:优化PCR体系,提高特异性;胶回收PCR产物;鉴定更多的克隆

⑵ 反应体系中混入了相同抗性的质粒:PCR扩增模板为环状质粒时,如扩增产物直接用于重组反应时需进行DpnI消化,或者进行胶回收纯化

 

Q4:插入片段出现碱基突变

  1. 测序的样本数:如果只测了一个样本,不一定可信,需要多测几个样本。
  2. 分析测序结果:检查突变处的测序信号是否有问题,若为双峰或者杂峰则不一定可信。
  3. 检查突变位点:如果多个结果突变位点一致,可能是从模板上的引入的或者模板序列与NCBI上不一致。
  4. 插入片段在PCR获得时使用高保真的聚合酶。
  5. 若引物处发生碱基突变,考虑是引物合成问题,建议重新合成引物进行实验。

 

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