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Phanta SE Super-Fidelity DNA Polymerase

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    P521(单页版说明书)V23.1.pdf

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    2023-09-15 15:13:00
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Phanta SE Super-Fidelity DNA Polymerase

快速扩增与保真度“兼具”的高保真单酶
价格:
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618.0
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货号:
P521-d1/d2/d3
所属分类
高保真PCR
数量:
-
+
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Phanta SE Super-Fidelity DNA Polymerase

快速扩增与保真度“兼具”的高保真单酶

分子克隆;基因鉴定;基因合成

Phanta SE Super-Fidelity DNA Polymerase是一款“兼具”快速扩增和保真度的高保真单酶,延伸速度5 sec/kb,保真度是Taq酶的106倍。应用了新一代热启动技术,配以合适的buffer及特异因子,扩增特异性和成功率显著提高。本款产品对常规模板、粗品模板(细菌、酵母、动植物裂解产物、全血样本等)、高GC/AT模板、 含尿嘧啶模板、含PCR抑制物模板(腐殖酸、乙醇、胆酸盐、血红素等)均可兼容。2 × Phanta SE Buffer中已经预混了dNTPs与镁离子,相比于一般单酶,简化了加样步骤,操作更加简便省时。

快速扩增:1 h即可完成10 kb以内片段的扩增(≤10 kb,延伸速度5 sec/kb;>10 kb,延伸速度10 sec/kb)。

保真度高:保真度为Taq酶的106倍。

适应性广:可兼容粗品模板、高GC/AT模板 (整体GC 24%-79%,局部GC 22%-88%)、甲基化模板、含PCR抑制物模板。

操作简便:“单酶 + buffer”,加样更简单。

1.快速扩增

使用Phanta SE Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme #P521,简称P521)以及市售其他高保真单酶(Supplier A、B-1、B-2、C和D),按照各自说明书推荐的反应体系及反应程序扩增相同模板,结果显示,P521以5 sec/kb的延伸速度,可以成功扩增7,311 bp的cDNA和7,476 bp的基因组DNA,扩增速度和成功率均较优。

图 1a 扩增10 kb片段所需的扩增时间对比

 

图 1b  5 sec/kb的延伸速度可成功扩增7,311 bp的cDNA及7,476 bp的基因组DNA

 

2.保真度高

采用二代测序方法(P. Mielinis. et al. Journal of Molecular Biology (2021)),测定不同聚合酶的扩增保真度。结果显示,Phanta SE Super-Fidelity DNA Polymerase保真度是Taq DNA Polymerase的106倍。

图 2 不同品牌高保真酶保真度比对

 

3.适应性广

使用Phanta SE Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme #P521,简称P521)以及市售其他高保真单酶(Supplier A、B-1、B-2、C和D),扩增粗品模板及高GC/AT模板,P521均可成功扩增。

图 3a 粗品模板扩增体系

 

图 3b 高GC/AT模板扩增体系

 

-30~-15℃保存,≤0℃运输

 

关键词:
P521-00
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Q1:扩增效率低,实验组无扩增条带。

A1:(1) 引物

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解;引物设计是否合理,可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

(2) 模板

长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开,此时加入PCR Enhancer(Vazyme #P021),可以有效降低解链温度;模板为粗品,存在抑制物,建议降低模板浓度(稀释使用;若样本为植物叶片,要确保植物为非多糖多酚植物,取新鲜幼嫩的叶片,并将叶片面积剪小,如黄枪头尖部面积大小);若模板为cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。

(3) 酶

反应所用的酶失活,建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。

(4) 扩增体系

反应体系配制错误,建议重复实验。

(5) 反应程序

检查变性温度是否准确,PCR仪指示温度与实际温度是否相符,如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活,温度过低则模板变性不彻底;退火温度不合适,可对退火温度设置梯度,摸索合适的退火温度;检查延伸时间是否充足。

 

Q2:扩增的条带亮度不太亮。

A2:(1) 引物

检查人工合成的引物是否降解。

(2) 模板

首先确认模板的质量,长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;如果模板没有了,可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。

(3) 反应程序

可梯度摸索最适宜退火温度;延长延伸时间,提高循环数。

 

Q3:扩增特异性差,非特异性扩增。

A3:(1) 引物

引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体,可降低引物浓度进行优化,必要时重新设计引物。

(2) 模板

模板不纯,被污染,需重新制备模板。

模板降解或过量,通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。

(3) 反应程序

反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带,可通过提高退火温度,降低循环数调整;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。

 

Q4:扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。

A4:(1) 胶

制胶时要使胶完全融化。

(2) 引物

检查引物是否降解。

(3) 模板

模板降解或过量,可通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新制备模板。模板的使用量请参考说明书。如果目的条带较长,模板是cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度,逆转录时不加随机引物重新逆转录。

(4) 反应程序

反应程序不够优化。退火温度不合适,可对退火温度设置梯度,摸索合适的退火温度。

 

Q5:空白对照出现扩增产物。

A5:(1) 引物设计不合理

扩增序列与非目的扩增序列有同源性,PCR也可以扩增出非靶序列的序列。

(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致,说明有污染

更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。

(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染,可用巢式PCR方法减轻或消除污染。

 

Q6:高保真酶扩增存在突变。

A6:高保真酶在PCR时扩增产物有突变,可以从以下几点来分析:

(1) 模板本身存在突变

检查模板,若模板是质粒,建议送质粒去测序;若模板是cDNA,建议重复实验,如果仍有突变,可能是cDNA有问题,建议重新制备cDNA,制备cDNA前检测RNA的完整度及纯度。

(2) 模板长时间在紫外光下照射,引入突变

切胶回收过程中避免长时间在紫外光下照射。

(3) 基因序列与NCBI上的不一致

建议再重复一次送去测序,若结果和上一次一样,说明序列可能和NCBI上的不一致。

(4) 少量序列存在非严谨序列

有相似重组序列,导致重组错位。

 

Q7:逆转录后的产物cDNA作为模板,使用高保真酶,一次应该加多少体积?

A7:说明书建议cDNA模板使用量为1-5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10),可在这个范围内尝试不同的使用量,摸索合适使用量。

 

Q8:细胞作为模板,使用高保真酶,模板投入量应该加多少?

A8:经测试,模板投入量建议投入10的3次方个细胞,模板投入量过多会抑制PCR反应。

 

Q9:高保真酶扩增产物是否带A尾,如何加A尾

A9:高保真酶扩增产物不带A,后续做克隆可尝试使用Vazyme拓扑克隆产品C603;若进行TA克隆可用普通的Taq酶进行加A尾。

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