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UltraClean Pathogen Multiplex AmpSeq Prep Kit for DNA&RNA (UDF)

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    UNA313(单页版说明书)V23.1.pdf

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    2023-11-28 09:08:10
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UltraClean Pathogen Multiplex AmpSeq Prep Kit for DNA&RNA (UDF)

洁净防污染,DNA&RNA病原tNGS共检多重扩增试剂再升级!
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UltraClean Pathogen Multiplex AmpSeq Prep Kit for DNA&RNA (UDF)

DNA&RNA病原tNGS扩增子建库试剂盒(UDF防污染)

洁净防污染,DNA&RNA病原tNGS共检多重扩增试剂再升级!

病原tNGS;DNA&RNA扩增子共建库

UltraClean Pathogen Multiplex AmpSeq Prep Kit for DNA&RNA (UDF) (Vazyme #UNA313)是基于两轮PCR法的多重扩增子建库试剂盒,适用于DNA和RNA病原微生物共检测。本试剂盒以超多重PCR为基础,引入UDF(dU-mediated double-strand DNA fragmentation)防污染技术,在保证检出率、扩增特异性、灵敏度和均一性的基础上,可有效防止环境中气溶胶污染造成的假阳性现象。本产品兼容逆转录体系,完整流程耗时低至3h,其中手动操作时间小于1.5 h,兼容模板起始量为1 ~ 500 ng。适用的Panel重数为1 ~ 500重(Panel GC范围为30%-80%),适用于Illumina和MGI等主流高通量测序平台。此外,本试剂的原料均经过严格的背景菌质控,可有效预防背景菌引起的假阳性问题,以保证检出结果真实可靠。

1)显著的防污染效果:UDF 防污染技术,轻松去除污染

2)兼容逆转录体系:逆转录后无需纯化,可直接进行多重扩增

3)严格的背景菌控制:车间洁净、人员专业、质控严格

4)优异的扩增性能:检出率高、特异性优、均一性好

以全 T 和含 dU 的模拟污染物为模板,分别投入 0.1ng,配制 qPCR 体系,在扩增体系中分别添加 UDG 酶、UDF 酶(Vazyme #UNA303所含消化酶)进行 37℃处理 10min,再进行 qPCR 扩增(采用 SYBR Green法)。结果表明,UDF处理组的污染清除效果显著优于UDG处理组。

 

表1.  UDG和UDF消除效率的qPCR对比测试结果

 

将人293T细胞gDNA和混合病原核酸以1000:1质量比混合构建病原模型(其中,混合病原核酸由17种DNA和RNA病原等质量比混制而成),使用Vazyme #PR111逆转录,以逆转录产物为模板进行两轮PCR,快速程序下完成扩增子文库构建(采用492重病原Panel)。结果显示,Vazyme #UNA313具有优异的检出率、特异性和均一性。

-30 ~ -15℃保存,≤0℃运输

关键词:
UNA313-01
UNA313-00
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Q1:建库产量偏低

A1:① 确认模板是否降解,重新定量模板,确认模板投入量是否正确,检查引物是否降解。

② 若模板质量较差,可适当提高循环数或使用高质量模板。

③ 若Panel重数较高,可调节扩增程序,如增加退火和延伸时间。

④ 降低退火温度,必要时进行退火温度梯度测试。

⑤ 产物纯化磁珠干燥环节,请勿过分干燥磁珠,磁珠过分干燥会降低DNA洗脱效率,影响产出。

 

Q2:引物二聚体较高

A2① 可适当调整引物的使用量。

② 可适当提高模板投入量,减少引物间随机结合概率。

③ 可降低多重扩增后的纯化乘数,纯化乘数可在0.6 - 1 ×之间调整。

 

Q3:存在非特异性扩增

A3① 减少循环数。

② 提高退火温度。

③ 减少引物使用量。

④ 重新设计引物。

 

Q4:部分区域漏检

A4① 可能设计的Panel与模板的匹配度不够高,建议对设计的Panel进行功能验证。

② 可能模板质量较差,部分区域缺失,需使用高质量模板。

③ 可能引物间GC比例或Tm值差异过大,部分区域扩增困难,建议对不符合条件的Panel重新进行调整。

 

Q5:文库均一度偏低

A5① 较短扩增子较少:可适当提高磁珠纯化乘数(提高至1.2 ×或1.5 ×)。

② 较长扩增子较少:可能为模板受损严重或PCR环节扩增不充分,请使用高质量模板或将PCR环节中延伸时间延长。

③ AT含量高的扩增子较少:增加退火时间或降低退火温度,但不建议降至55℃以下。

④ GC含量高的扩增子较少:可以通过在扩增体系中添加5% - 10% DMSO,或者甜菜碱进行调整。

 

Q6:防污染效率偏低

A6① 将多重扩增消化阶段的反应时间由10 min调整至15 min。

② 可能原实验室已存在的气溶胶污染对多重扩增产生影响,可以采用核酸清除剂等对实验室进行消杀,去除已有的气溶胶污染。

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