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HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)

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R123说明书-V22.1.pdf

大小：

2022-05-18 17:28:46

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4193

HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)

预混液形式的两步法RT-qPCR 试剂（去基因组）

价格：

1150.0

市场价

元

1150.0

浏览量:

4193

货号：

R123-01

所属分类

RT-qPCR专用预混液

数量：

库存:

9999

*具体价格咨询当地业务员

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组分

说明书

相关文献

HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)

预混液形式的两步法RT-qPCR 试剂（去基因组）

第一链cDNA合成；逆转录（含gDNA去除）;基因表达分析；两步法qRT-PCR检测

· 即用型的SuperMix 预混液使用方便省时

· gDNA wiper Mix 可迅速去除基因组污染

HiScript 两步法RT-qPCR 系列试剂盒（含gDNA 去除模块）以高性价比的HiScript Reverse Transcriptase 为基础，对反应体系进行大幅简化，即用型的SuperMix 将合成高质量第一链cDNA 所需的所有成分合并为一管5 × SuperMix，只需加入RNA和水即可进行逆转录反应，且SuperMix 在-20℃不会冻结，使用方便。产品中包含的4 × gDNA wiper 可在逆转录前快速去除体系中潜在的基因组干扰。本产品操作简便，降低操作过程中的污染机率。合成的cDNA 可以用于SYBR Green qPCR 分析法和探针分析法，进行高性能的基因表达分析。

-30 ~ -15℃保存。

关键词:

R123

逆转录PCR

逆转录cDNA合成

逆转录试剂

第一链cDNA合成

RT-qPCR预混液

逆转录预混液

去基因组的逆转录试剂

反转录试剂

即用型RT SuperMix

cDNA合成

RT-PCR；RT-qPCR

Q1：原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗？

A1：可以。原核生物RNA没有polyA尾，所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。

Q2：逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix，可以去除残留在RNA中的基因组。最多可以去除多少的基因组？但如果不进行基因组去除，会影响接下来的逆转录吗？

A2：我们做过100ng基因组的测试，去除效率是99.95%。如果不进行基因组去除不会影响逆转录实验的进行，但是如果基因组残留严重但不去除的话，会影响接下来定量实验的准确性。

Q3：延长逆转录时间，是否可以提高逆转录效率？

A3：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升；对于一些GC含量较高或含高级结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。

Q4：做了No RT Control发现有gDNA残留怎么办？

A4：如果使用试剂盒中的gDNA wiper模块进行gDNA去除，但No RT Control仍有C_T值，可通过实验组和No RT Control组的C_T值来判断实验数据是否可用。当实验组C_T值与No RT Control对照组C_T值差值大于5，说明由gDNA导致的误差小于5%，则可以忽略gDNA污染；若实验组与对照组C_T值差值小于3或者几乎一致，则实验组扩增产物的模板很大一部分来源于gDNA，这样的实验组就失去定量意义。

Q5：如何评判RNA质量？

A5：RNA质量从两个方面反应：

(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则 RNA 已完全降解，需要重新提取。

(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD_260/280和OD_260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断，蛋白、离子等残留会使比值降低。

Q6：如何选择逆转录的引物？

A6：根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。

(1) 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

(2) Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

(3) 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。

cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。

Q7：可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？

A7：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。