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HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)

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  • cp

    R312说明书-V22.1.pdf

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    2022-05-27 11:26:21
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HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)

HiScript®III1stStrandcDNASynthesisKit(+gDNAwiper)第三代高效cDNA一链合成试剂盒(去基因组)基于更高效的HiScript®IIIReverseTranscriptase:逆转录效率高于二代产品灵活选择引物:针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物gDNAwiperMix可迅速彻底去除基因组污染:保证后续结果更加可靠,并可简化qPCR引物设计,
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说明书

HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)

第三代高效cDNA 一链合成试剂盒(去基因组)

基于更高效的HiScript® III Reverse Transcriptase:逆转录效率高于二代产品

灵活选择引物: 针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物

gDNA wiper Mix可迅速彻底去除基因组污染:保证后续结果更加可靠,并可简化qPCR引物设计,无需跨内含子设计引物

1.后续实验为PCR

以1μg  HeLa细胞RNA为模板,按照R302说明书推荐体系进行逆转录,以1μl cDNA为模板,用2 ×Vazyme Lamp® Master Mix (Dye Plus)(Vazyme #P312)进行长片段扩增,将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图1所示:扩增条带单一且产量高

图1.长片段扩增电泳图

注:M:DL15000 Marker(Vazyme #MD103)

2.后续实验为qPCR

以100 ng HeLa 细胞 RNA为模板,使用 HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)(Vazyme #R312) 以及市售其他逆转录产品 (分别来自Supplier Ta、Th1、Th2、N、P、R、B、Tr、Ti),按照各自说明书推荐程序进行逆转录反应。将得到的 cDNA 进行多个基因的 qPCR定量分析。以不同公司产品为横坐标,△CT (△CT = Vazyme #R312 cDNA扩增CT值–各公司逆转录产品 cDNA 扩增CT值)为纵坐标绘图。从图中可以看出,除一些体系Th1△CT>0外,其余公司逆转录产品均△CT<0,说明 Vazyme #R312逆转录效率优于Ta、Th2、N、P、R、B、Tr、Ti 相关逆转录产品。

HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)是HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)的升级版本,包含新一代逆转录酶HiScript® III Reverse Transcriptase和针对逆转录优化的最适Buffer,进一步提高了一链合成的效率。该试剂盒中的5 × gDNAwiper Mix可在42℃,2 min条件下快速去除基因组DNA污染,保证后续结果更加可靠,并可简化qPCR引物设计,无需跨内含子设计引物。试剂盒中包含单组分逆转录引物Oligo (dT)20VN和Random hexamers,用户可根据需要,灵活选择逆转录引物进行后续实验。本试剂盒既可合成用于克隆等下游实验的全长cDNA (可达20 kb),亦可合成高度均一的用于qPCR定量的cDNA。

- 30℃~- 15℃保存。

关键词:
HiScript ® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)
R312
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Q1:如何评判RNA质量

A1:RNA质量从两个方面进行检测:

⑴ RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例,完整的总RNA有清晰的三条带,分子量从大到小分别为28S、18S、5S,并且28S是18S亮度的两倍;若能看见三条带,但带型模糊或弥散,则说明RNA有部分降解,此时请立即进行逆转录反应,并适量加大模板量;若只能看见分子量很小的一条带或没有条带,则RNA 已完全降解,需要重新提取

⑵ RNA的纯度。RNA的纯度可以通过测定OD260/280和OD260/230两个比值,在1.8-2.1范围内表示纯度较高。

注:建议使用1%的琼脂糖凝胶,210V电泳10-12min;加好loading后的RNA可以放置在PCR仪上70℃,2min,使RNA变性后再进行电泳,这样跑出来的RNA条带更好看,也更能反应RNA的完整性;

 

Q2:如何选择逆转录的引物

A2:逆转录三种引物:

⑴ 随机引物:随机结合在RNA的任何区域,适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

⑵ Oligo dT:适用于具有PolyA尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾)。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上,所以对 RNA 样品的质量要求较高,即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

⑶ 基因特异性引物:与模板序列互补,适用于序列已知的基因逆转录。

引物选择依据: cDNA后续进行PCR扩增长片段,一般用Oligo dT或者基因特异性引物,不建议使用随机引物,因为随机引物是随机结合的,cDNA片段会偏短;cDNA后续进行qPCR,一般使用Oligo dT和随机引物的混合物,可以避免3’端的扩增偏好性。

 

Q3:对于逆转录加样的操作注意事项

A3:⑴ 4 × gDNA wiper Mix、5 × HiScript III qRT SμperMix及5 × No RT Control Mix含有高浓度的甘油,在使用前请短暂离心收集到反应管底部,并用移液枪轻轻吸打充分混匀后准确吸取。

⑵ 20 µl逆转录反应体系建议加入不超过1 µg的Total RNA。如果目的基因表达量非常低,最多加入5 µg total RNA,否则加入RNA量过高, 可能会超出后续定量PCR的线性范围。

⑶ 可以不进行基因组去除步骤,直接用逆转录试剂进行逆转录,但是请勿将4 × gDNA wiper Mix与不含基因组去除模块的试剂配套使用(如与R222配套使用),因为不含基因组去除模块的试剂盒中的Mix不含终止gDNA wiper反应的成分,有可能会影响cDNA稳定性。

 

Q4:可以通过检测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗?

A4:不可以,逆转录产物cDNA是混合物,除了cDNA产物以外,还有bμffer、逆转录酶、引物,同时还包含未转录的模板RNA,总RNA中的tRNA、rRNA等,都会干扰浓度测定结果,因此不能反应真实的cDNA产量;cDNA同样不可以纯化,因为逆转得到的cDNA长短不一,纯化会损失短的cDNA。

 

Q5:cDNA模板需要稀释吗?应该稀释多少倍进行定量?

A5:没有具体的稀释参考倍数,一般cDNA每稀释10倍CT值变大3.3,可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用cDNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液作为模板进行定量实验,根据规律选择CT值落在18-28范围内的稀释倍数。也可以参考换试剂之前的稀释倍数。

注:当使用 cDNA 原液进行检测的时候,使用量不能超过qPCR 反应体系的 1/10,因为 cDNA 中包含很多抑制 qPCR 的组分,cDNA 体积大时风险很高。

 

Q6:逆转录试剂盒可以用于lncRNA和cirRNA吗?

A6:可以,和普通的RNA逆转类似。不过lncRNA比较长,建议在去除基因组步骤前先进性65℃ 5min预变性,打开二级结构再进行逆转录。并不是所有的LncRNA都包含PolyA 尾,所以如果使用逆转录试剂盒,可以同时添加随机引物与OligodT两种引物,或者只添加随机引物一种引物,但不能只添加Oligo dT一种引物。

cirRNA为环状闭合结构,没有poly A尾,逆转录时只加随机引物。cirRNA长度跨度较大,比较长的话建议跟lncRNA一样先预变形,正常的话就按照正常程序就行了。

关于引物的选择,总的来讲:

mRNA可以选用随机引物+OligodT;随机引物;OligodT;GSP(基因特异性引物);

cirRNA可以选用随机引物;GSP(基因特异性引物);

LncRNA可以选用随机引物+OligodT;随机引物;GSP(基因特异性引物);LncRNA在进行逆转录之前需要进行RNA预变性。

 

Q7:与二代逆转录产品相比,三代逆转录产品的优势是什么?

A7:(1)与二代产品相比,三代酶CT值偏小1-2 Cycles;

       (2)三代产品对于降解的RNA逆转录效率高,可逆转Rin=2.5的RNA;

       (3)在高RNA模板(1-5 μg)投入的情况下,依然具有很高的逆转录效率;

       (4)对乙醇、异丙醇、酚、异硫氰酸胍(RNA提取中引入的杂质)等常见杂质耐受度极高。

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